酶法提取荊芥總黃酮的研究1)

公衍玲,金宏,黃山,金巖,張丹丹

(青島科技大學化工學院藥學系,山東 青島 266042)

荊芥為唇形科植物荊芥(Schizonepeta tenuif oliaBriq.)的干燥地上部分,其味辛,微溫,歸肺、肝經,具有解表散風、透疹、消瘡、止血等功效,臨床應用廣泛。荊芥中的主要化學成分包括揮發油類、酚類、酸類、黃酮類化合物[1],而黃酮類化合物具有降血脂、抑制血栓形成、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、鎮痛、保肝等多種生物活性,日益受到國內外學者的關注[2-3]。新的提取技術和方法不斷涌現,使黃酮類化合物的提取研究也在不斷更新和深入,其中生物酶解技術應用于中藥提取呈現出良好的應用前景。是根據植物細胞壁的構成,利用酶反應所具有高度專一性的特點,選擇相應的酶,將細胞壁的組成成分(纖維素、半纖維素和果膠質)水解或降解,破壞細胞壁結構,使細胞內的成分溶解、混懸或膠溶于溶劑中,從而達到提取目的,且有利于提高成分的提取率[4]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱,具有分解、軟化纖維素、破壞細胞壁、增加植物細胞內容物的溶出量的作用,廣泛應用于中藥有效成分的提取[5-7]。本文擬將纖維素酶用于提取荊芥總黃酮,并獲得了最佳提取工藝,現報導如下。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

荊芥,四川省綿陽市;纖維素酶,寧夏夏盛實業集團有限公司;蘆丁,中國藥品生物制品檢定所;其它試劑均為市售分析純。UV762紫外/可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;DHS-25型pH計,上海精科雷磁;RE-52型旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 荊芥總黃酮的酶法提取工藝流程。準確稱取荊芥5g,加入一定溫度的水中,調節介質的pH,加入一定量的酶,恒溫提取一定時間,升溫滅酶后再用水浸提1.5h,過濾,將濾液濃縮至約100mL,待測。

1.2.2 荊芥提取物中總黃酮的測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制:精密量取蘆丁標準溶液 0 、1.0、2.0 、3.0 、4.0、5.0mL,分別置于 25mL 容量瓶中,各加30%乙醇5mL,再各精密加入5%NaNO2溶液0.7mL,搖勻,放置6min,然后再各精密加入10%Al(NO3)3溶液 0.7mL,搖勻,放置6min,最后再各精密加入1mol/L的NaOH溶液10mL,分別用30%乙醇稀釋至25mL,搖勻,放置15min后,置比色皿中,用紫外可見分光光度計在510nm處測吸光度。以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為y=9.9943x+0.0103,R2=0.9997。

1.2.2.2 荊芥中總黃酮的測定:取1.2.1項下的濾液2mL置10mL容量瓶中,按照1.2.2.1項下的方法測吸光度,計算總黃酮的質量,并計算總黃酮得率(總黃酮得率=提取液中總黃酮質量/荊芥質量×100%)。

1.2.3 單因素實驗設計。影響酶法提取的因素有粉碎度、料液比、酶解溫度、酶解 pH 值、酶解時間、酶的用量,按照單因素實驗設計思路,考查各因素對總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交實驗設計。在單因素實驗的基礎上,篩選影響提取的主要因素,設計了四因素三水平的正交實驗,采用L9(34)表安排實驗。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對荊芥總黃酮提取的影響

準確稱取荊芥各5g,粉碎至60目、40目、30目、20目、10目,按料液比1∶10、酶解溫度 40℃、酶解 pH 值4、酶的用量 1.0%(藥材干重)、酶解時間30min處理后,煎煮1.5h,實驗結果見圖1。

圖1 粉碎度對荊芥總黃酮提取的影響

隨著粉碎度的增加,總黃酮的得率總體上逐漸增加,原因可能是粉碎度的增大有利于增大溶劑與物料的接觸面積,從而有利于總黃酮的溶出。當達到50目時,總黃酮的得率變化趨于平緩,且粉碎度的增加不利于分離過濾。因此綜合考慮,選擇荊芥的粉碎度應為50目左右。

2.1.2 料液比對酶法提取荊芥總黃酮提取率的影響

準確稱取50目荊芥各5g,分別加入料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的水,在酶解溫度 40℃、酶解pH值4、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解時間30min處理后,煎煮1.5h,實驗結果見圖2。

圖2 不同料液比對荊芥總黃酮提取的影響

隨著料液比的增加,總黃酮得率逐漸增加,當料液比達到1∶12時,總黃酮得率達最大值,而后隨著料液比的增加,總黃酮得率反而有所下降,但下降的趨勢不是很明顯。分析可能原因,隨著料液比的增大,反應體系中的水分會增加,從而降低了反應產物的濃度,減少了產物對酶促反應的反饋抑制作用,總黃酮得率會增加,但隨著反應體系中水分的增加,酶的濃度也會相應的有所下降,總黃酮得率變化趨于平緩。故選擇料液比為1∶12。

2.1.3 酶解溫度對酶法提取荊芥總黃酮提取的影響

準確稱取50目荊芥各5g,料液比1∶10、酶解pH值4、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解溫度分別設為30 、35 、40、45 、50℃,酶解 30min 后,煎煮 1.5h,實驗結果見圖3。

圖3 酶解溫度對荊芥總黃酮提取的影響

隨著溫度的升高,總黃酮得率隨之增大,在35～45℃時達到最大,而后隨著溫度的升高,總黃酮利率開始下降降低。該纖維素酶的最適溫度為40℃,溫度過高會破壞酶的活性。

2.1.4 酶解pH對荊芥總黃酮提取的影響

準確稱取50目荊芥各5g,按料液比1∶10、酶解溫度40℃、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解pH值分別設為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,酶解 30min 后,煎煮1.5h,實驗結果見圖4。

圖4 酶解pH對荊芥總黃酮提取的影響

從圖4可以看出,總黃酮得率隨著酶解液初始pH值的增大而增大,在pH=5時達到最大,繼續增大pH值,總黃酮利率反而減小。因為纖維素酶的活力受環境pH值影響,在一定pH值下,纖維素酶的反應達到最大速度,pH5即為該該纖維素酶的最適pH值。

2.1.5 酶解時間對荊芥總黃酮提取的影響

準確稱取50目荊芥各5g,按料液比1∶10、酶解pH 值4、酶解溫度40℃、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解時間分別設為20、30、40、50、60、90、120min后 ,煎煮1.5h,實驗結果見圖5。

圖5 酶解時間對荊芥總黃酮提取的影響

從圖5可以看出,隨著酶解時間的延長,總黃酮利率逐漸下降,酶解50min之后,總黃酮利率基本穩定在一較低的水平。從理論上講,酶解反應時間和酶解進行程度有著密切的關系,反應時間太短,酶解不充分,而當酶濃度達一定值時,酶促反應時間的延長并不能顯著增加浸提率,甚至開始下降。本實驗發現,酶解20min即可獲得較好的效果。

2.1.6 酶的用量對荊芥總黃酮提取的影響

準確稱取50目荊芥各5g,按料液比1∶10、酶解pH值4、酶解溫度40℃、酶的用量分別設為 0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.4%(藥材干重),酶解30min后,煎煮1.5h,實驗結果見圖6。

圖6 酶的用量對荊芥總黃酮提取的影響

從圖6可以看出,總黃酮得率隨著酶用量的增大而增加,當酶用量為1.2%時,其濃度為最大,繼續增加酶用量,總黃酮得率反而減小。在保持體系中其他成分不變的條件下,隨著酶用量的增加,纖維素酶與纖維素分子的接觸機會增加,在同一時間內,細胞壁中的纖維素水解速度提高,致使黃酮類化合物很快分離出來;達到最大值后,隨著酶用量的增加,底物被酶分子所飽和,酶解反而有可能存在競爭抑制,使酶解不徹底,另外也是酶的一種浪費。酶的用量適宜控制在1.2%。

2.2 正交實驗結果

根據單因素實驗考察的結果,確定酶解最適pH為5,最佳酶解溫度為40℃,其他因素選取最佳實驗條件附近的三個水平,進行四因素三水平的正交實驗,以總黃酮得率為評價指標,實驗結果見表1。

表1 正交實驗結果

表2 正交實驗的方差分析表

從表1和表2可以看出,各因素對提取效果的影響為粉碎度＞酶解時間＞酶的用量＞料液比,其中粉碎度、酶解時間和酶的用量對提取率的影響均具有顯著意義。結合單因素實驗結果,最佳提取工藝條件為:藥材粉碎至50目,料液比為1∶16,酶的用量為0.8%,酶解溫度為40℃,酶解pH值為5,酶解時間為20min后,煎煮1.5h。以此提取工藝做3組驗證試驗,其總黃酮平均得率為1.174%,說明該工藝條件穩定,提取率高。

2.3 驗證實驗

按照上述工藝條件進行了三組驗證實驗,其結果如表3,總黃酮的平均得率為1.174%,最高得率可達1.215%。

表3 驗證實驗數據表

3 結論

3.1 本文通過單因素實驗和正交實驗獲得了酶法提取總黃酮的最佳工藝條件為:荊芥藥材粉碎至50目,料液比為1∶16,酶的用量為0.8%,酶解溫度為40℃,酶解pH值為5,酶解20min后,煎煮1.5h。該工藝條件重現性好,荊芥總黃酮得率可高達1.215%。

3.2 酶解預處理與傳統水煎法相結合可用于荊芥總黃酮的提取,該法反應條件溫和,能耗低,還可避免使用有機溶劑,從而實現中藥的綠色提取和清潔化生產。

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