酶法提取黑木耳多糖的純化與鑒定

李福利,張麗娟,于國萍*

(1.黑龍江省森林工程與環境研究所,哈爾濱 150040;2.東北農業大學,哈爾濱 150030)

黑木耳不但是營養價值很高的食用菌,而且是藥用價值較高的、世界公認的保健品[1]。黑木耳多糖具有抗腫瘤、抗潰瘍、增強機體免疫力、促進核酸的生物合成等方面的作用[2]。對于食用菌多糖的提取以往主要采用發酵法、熱水浸提法、酸堿浸提法和鹽析法為主[3],2005年,張麗娟等研究表明[4],采用復合酶(由纖維素酶、果膠酶和蛋白酶按一定比例組成)提取黑木耳中多糖物質,提取率明顯高于水浸提及酸堿浸提,且條件溫和,雜質易除,同時對酶法提取條件進行了優化及脫蛋白工藝的探討[5],得到了黑木耳多糖粗品。本文就此基礎上,對黑木耳的有效成分之一——黑木耳多糖進行了初步的純化與組成確定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑木耳:中國龍江森林工業集團總公司生產(黑森牌);纖維素酶(4萬酶活/g):天津利華酶制劑有限公司);果膠酶(2萬酶活/g):天津利華酶制劑有限公司;木瓜蛋白酶(25萬酶活/g):丹麥諾維信公司;透析袋:8000-12000,購于海浪科技有限公司;SephadexG-200、SepharoseA-200:購于海浪科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖粗品的制備

按照文獻[4]制得黑木耳多糖提取液,提取液濃縮,再經過無水乙醇沉淀得到絮狀黑木耳多糖沉淀,然后將沉淀復溶于水中,濃縮溶液至一定體積,凍干,得到黑木耳多糖粗品,為淡黃色絮狀。

1.2.2 黑木耳多糖的純化

1.2.2.1 改進Sevag法去除蛋白質。將得到黑木耳多糖粗品復溶于水中,用改進Sevag法去除蛋白質[5],得到黑木耳粗多糖。

1.2.2.2 Sephadex G-200凝膠層析。用Sevag法脫除蛋白質的黑木耳粗多糖,再次用無水乙醇沉淀,取沉淀多糖復溶于水中,使其終濃度約為20mg/mL,取4mL上樣于事先用0.1mol/L NaCl溶液平衡好的SephadexG-200凝膠柱(2.0cm×40cm)中,用0.1mol/L NaCl溶液洗脫,控制流速為20mL/h,每管收集4mL,苯酚-硫酸法跟蹤檢測,作洗脫曲線。收集多糖峰組分,透析、濃縮、冷凍干燥后得到白色黑木耳多糖粉末。

1.2.3 黑木耳多糖的純度鑒定

1.2.3.1 SepharoseA-200凝膠層析。取純化后,透析,濃縮得到的黑木耳多糖溶液AAP1和AAP2,使其終濃度約為 20mg/mL,上樣于用0.1mol/L NaCl溶液平衡好的 Sepharose A-200層析柱(2.0cm×40cm)中,用0.1mol/L NaCl溶液洗脫,控制流速為20mL/h,每管收集4mL,分部收集,苯酚-硫酸法跟蹤檢測,作洗脫曲線。

1.2.3.2 紫外光譜掃描。將純化后的多糖收集液,透析,濃縮,凍干得到的黑木耳多糖純品溶解后作紫外光譜掃描,觀察光譜掃描結果。

1.2.3.3 黑木耳多糖的官能團分析

1.2.3.4 外光譜掃描。凍干得到的黑木耳多糖純品,做紅外光譜掃描。

1.2.4 層析黑木耳多糖的組分分析

合并柱層析得到的黑木耳多糖收集液的多糖峰組分,透析、濃縮凍干得到黑木耳多糖純品,然后溶于5mL 2mol/L硫酸中,密封后置于100℃恒溫水浴中水解8h,然后用BaCl2溶液中和,過濾,取濾液濃縮,點樣于中華1#層析專用濾紙上,點樣量為2μ L,置于層析缸中,展層,展層劑為正丁醇:醋酸:水的混合溶液,其體積比為4∶1∶5。顯色劑為苯胺-鄰苯二甲酸溶液。噴霧顯色后,于105℃加熱5min,觀察層析結果。

1.2.5 多糖含量的測定

總糖測定采用苯酚-硫酸法,還原糖測定采用DNS法[6]。多糖含量=總糖量—還原糖量。

2 結果與討論

2.1 Sephadex G-200凝膠層析

黑木耳多糖提取液經過無水乙醇沉淀,Sevag法去除蛋白質,透析,濃縮再次醇沉后得到絮狀黑木耳多糖沉淀,取沉淀多糖配成配成20mg/mL的多糖溶液,上樣于 Sephadex G-200凝膠柱中,用0.1mol/L NaCl溶液洗脫,分步收集,用苯酚-硫酸法跟蹤檢測,作出洗脫曲線,結果見圖1。

圖1 黑木耳多糖Sephadex G-200凝膠層析圖譜

由圖1可以看出,黑木耳多糖含有兩種組分,分別用AAP1、AAP2表示,其中主要成分是AAP1,合并相同洗脫峰,即收集19～38管為AAP1,收集39～55管為AAP2。經過透析,濃縮,冷凍干燥,即得到黑木耳多糖純品,為白色粉末狀物質。

2.2 黑木耳多糖的Sepharose A-200凝膠層析純度鑒定

純化后的黑木耳多糖收集液AAP1和AAP2,濃縮后,取4mL上樣于0.1mol/L NaCl溶液平衡好的Sepharose A-200凝膠柱中,然后用0.1mol/L NaCl溶液洗脫,控制流速為20mL/h,分步收集,每管收集4mL,苯酚-硫酸法跟蹤檢測,做出洗脫曲線。實驗結果見圖2和圖3。

圖2 黑木耳多糖AAP1的純度鑒定

圖3 黑木耳多糖AAP2的純度鑒定

由圖可以看出黑木耳多糖AAP1,AAP2均為單一對稱洗脫峰,說明黑木耳多糖樣品中的兩種組分純度很高,符合物理化學分析標準。

2.3 紫外光譜掃描

將凍干得到的黑木耳多糖純品AAP1,溶解于水中作紫外光譜掃描,掃描結果見圖4。

圖4 紫外光譜掃描圖

由圖4可知,在260nm和280nm處無吸收峰,即黑木耳多糖樣品中不含有核酸、多肽和蛋白質物質。

2.4 黑木耳多糖的紅外光譜掃描官能團分析

分析結果見圖5所示,在4000～650cm-1呈多糖類物質的特征吸收峰。3500～3000cm-1的尖峰是O-H的伸縮振動引起的,在3000～2800cm-1之間的尖峰是由糖類C-H的伸縮振動引起的,1450～1120cm-1的峰是C-H的變角振動,這兩組峰是糖類的特征吸收峰;在1127cm-1附近微弱的吸收峰是吡喃糖β-型C-H變角振動的吸收峰,1629cm-1附近的吸收峰是糖的水化物,因此推斷該木耳多糖為一種β-吡喃多糖。

圖5 紅外光譜掃描

2.5 紙層析法黑木耳多糖的組分分析

合并經過凝膠柱層析純化后的多糖收集液AAP1,透析除去鹽離子,然后濃縮、凍干得到白色黑木耳多糖純品,溶于2mol/L硫酸中,密封,置于100℃水浴中水解8h,然后用BaCl2溶液中和,過濾去除沉淀,濃縮,點樣于中華1#層析專用濾紙,用展層劑展開,噴霧顯色后,結果見圖6。由紙層析圖譜可以看出,AAP中含有葡萄糖

圖6 AAP水解物的紙層析圖譜

(Glu)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Arb),Rf相對比值為Glc∶Xyl∶Gal∶Man∶

Arb=1∶1.32∶0.88∶1.06∶1.18。說明黑木耳多糖是一種雜多糖。

3 結論

3.1 利用優化改進的Sevag法可以很好的脫除黑木耳多糖粗品中的蛋白質。

3.2 Sephadex G-200可以用來分離純化黑木耳多糖,獲得 AAP1和 AAP2黑木耳純多糖兩個組分,其中AAP1為主要組分。

3.3 黑木耳純多糖的純度鑒定:Sepharose A-200凝膠柱層析洗脫后得到單一對稱洗脫峰;紫外光譜掃描在260nm和280nm處沒有吸收峰,說明不含核酸、多肽和蛋白質物質。

3.4 紅外光譜掃描的結果表明,在3500～3000 cm-1之間的峰是O-H的伸縮振動引起的,3000～2800cm-1和1500～1100cm-1之間的吸收分別是C-H的伸縮振動和變角振動,是多糖類物質的特征吸收峰,推斷該木耳多糖為一種β-吡喃多糖。

3.5 紙層析結果表明,黑木耳多糖由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖5種單糖組成,說明黑木耳多糖是一種雜多糖。

[1]陳和生,孫振亞.黑木耳多糖的研究進展[J].時珍國醫國藥,2003,14(5):300-301.

[2]張秀娟,季宇彬.黑木耳多糖藥理學研究進展[J].中國微生態學雜志,2003,15(6):373-374.

[3]陳艷秋,周麗萍.而木耳子實體水溶性多糖提取工藝的研究[J].吉林農業大學學報,2003,25(4):470-472.

[4]張立娟,于國萍,周國華.黑木耳多糖酶法提取條件的研究[J].食品研究與開發,2005,26(3):89-91.

[5]張立娟,于國萍.黑木耳多糖酶法提取條件的優化及脫蛋白工藝的研究[J].食品工業科技,2005(5):109-111.

[6]張維杰.復合多糖生化研究技術[M].上海:上海科學技術出版社,1987.