烏蘇里藜蘆生物堿單體計米丁的抗動脈血栓作用

呂 莉，潘 平，韓國柱，周 琴，趙偉杰，王世盛，陸文婷

(1.大連醫科大學 藥理教研室，遼寧 大連 116044；2.大連理工大學 精細化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116012；3.大連友誼醫院 藥劑科，遼寧 大連 116001)

藜蘆(Veratrumnigrum) 系百合科多年生草本植物，《神農本草經》及《本草綱目》等均有記載。《中藥大詞典》等稱“藜蘆可用于治療中風失語、黃疸、疥瘡”等[1]，由此提示藜蘆可能具有抗血栓等方面的作用。本研究組一直致力于研究烏蘇里藜蘆的有效成分及其藥理作用，既往研究表明從藜蘆中提得的總堿具有降壓[2]、改善血流動力學[3,4 ]、中樞抑制作用[5]，并首次發現了藜蘆總堿具有強大的抗動、靜脈血栓作用[6]。本工作組對其生物總堿進行了一系列的化學成分研究，迄今已分離出11種酯型異甾體生物堿[7-9]，其中的一種單體經用現代分析技術鑒定為計米丁(germidine)[10,11]，其化學結構如圖1所示。本文旨在研究計米丁的抗動脈血栓作用，從而確定烏蘇里藜蘆生物堿的抗血栓活性成分。

圖1 計米丁的化學結構

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

鹽酸計米丁注射液(500 μg·mL-1)由大連理工大學化學制藥系提供；賴氨匹林(Aspirin-DL-Lysine,LAS)，安徽安寶藥廠產品；ADP，美國Sigma公司產品。

1.2 動 物

SD大鼠，雄性，180～220 g，清潔級，大連醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(遼)2008-0002。

1.3 儀 器

LBY-NJ2型普利生血液凝聚儀，北京普利生儀器公司產品；BT87-3型體內血栓形成測定儀，包頭醫學院心血管研究室產品。

1.4 方 法

1.4.1 血流阻塞時間(OT)的測定

大鼠70只，隨機分為7組：生理鹽水(NS)組，計米丁1.3 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1組，以及陽性對照藥物賴氨匹林(LAS)18.0 mg·kg-1(相當于阿司匹林10.0 mg·kg-1)組。大鼠腹腔注射烏拉坦1 g·kg-1麻醉，分離一側頸總動脈，將體內血栓形成儀的刺激電極置于頸總動脈近心端，遠心端置一溫度傳感器，大鼠舌下靜脈注射受試藥物后20 min以強度為1.6 mA直流電連續刺激頸總動脈7 min，引起血管內膜損傷，從而形成血栓。記錄從電刺激開始到溫度驟降所需時間，即血流阻塞時間(Occlusion Time,OT)[6,12]。以NS組為基準，計算不同給藥組OT延長百分率。

1.4.2 體內血小板聚集率的測定

大鼠60只，隨機分為6組：NS組，計米丁2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1組，以及陽性對照藥物 LAS 18.0 mg·kg-1組。大鼠自尾靜脈注射受試藥物后20 min于麻醉狀態下自腹主動脈取血，以3.8 %枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑體積比為9∶1)，以800 r/min離心10 min,取上清即獲得富血小板血漿(PRP),剩余血漿經3000 r/min離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)。用PPP調PRP使其含血小板數為3×108·mL-1，以終濃度3 μmol·L-1的ADP為誘導劑，按Born法[13]于血液凝聚儀中測定血小板5 min最大聚集率。以NS組為基準，計算不同給藥組血小板聚集抑制百分率。

1.4.3 體外血小板聚集率的測定

大鼠60只，按1.4.2項取血，制備PRP和PPP。用PPP調PRP血小板數至3×108·mL-1，于PRP中分別加入不同濃度受試藥物，使其終濃度分別為計米丁6.3 μg·L-1、12.5 μg·L-1、25.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1,陽性對照藥LAS 40.0 mg·L-1，NS組加入等容量NS。再按1.4.2操作測定血小板5 min最大聚集率。以NS組為基準，計算不同給藥組血小板聚集抑制率，并計算計米丁體外抑制血小板聚集的半數抑制濃度IC50。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 計米丁對大鼠電刺激頸動脈血栓形成的影響

如表1所示，隨著計米丁給藥劑量的逐漸增大，OT值逐漸延長，且呈良好的量效關系。

表1 靜脈注射計米丁對大鼠動脈血栓形成的影響

Tab 1 Effect of germidine (iv) on carotid artery thrombosis in rats

表1 靜脈注射計米丁對大鼠動脈血栓形成的影響

1)與NS組相比,P<0.05；2)與NS組相比,P<0.01

組別OT(s)OT延長率(%)NS683.0±28.6-計米丁1.3 μg·kg-1794.9±49.21)16.4計米丁2.5 μg·kg-1869.7±58.72)27.3計米丁5.0 μg·kg-1913.6±32.72)33.8計米丁10.0 μg·kg-1982.9±49.72)43.9計米丁20.0 μg·kg-11133.7±198.52)66.0LAS 18.0 mg·kg-11040.2±53.32)52.3

2.2 計米丁對大鼠體內、外血小板聚集率的影響

如圖2所示，NS組、計米丁2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1組和LAS 18.0 mg·kg-1組大鼠5 min內血小板最大聚集率分別為(69.9±3.3)%、(54.0±5.4)%、(42.0±5.7)%、(36.7±4.2)%、(25.9±5.1)%和(36.9±4.3)%。與NS組相比，計米丁從小到大劑量組血小板聚集抑制率分別為22.7%、39.9%、47.4%、62.9%(P<0.01)，LAS陽性對照藥LAS組血小板聚集抑制率為47.2%(P<0.01)。

如表2所示，隨著計米丁終濃度的增大，ADP誘導的大鼠5 min內血小板最大聚集率值逐漸降低，與NS組相比，呈劑量依賴性地抑制ADP誘導的大鼠體外血小板聚集。計米丁終濃度25.0 μg·L-1與LAS 40.0 mg·L-1的作用強度相當。以血小板聚集抑制率的概率單位(Y)對計米丁終濃度的對數(X)作圖，得線性回歸方程Y=1.26X+3.15(r=0.9980)，計算得計米丁在體外抑制血小板聚集的半數抑制濃度IC50=29.3 μg·L-1。

圖2 靜脈注射計米丁對大鼠體內血小板聚集的影響

表2 計米丁對大鼠體外血小板聚集的影響

Tab 2 Effect of germidine on ADP induced platelet aggregation in vitro rats

表2 計米丁對大鼠體外血小板聚集的影響

1)與NS組相比，P<0.01；2)與LAS組相比，P>0.05

組別5 min內血小板最大聚集率(%)抑制率(%)NS67.9±3.6-計米丁6.3 μg·L-154.8±4.51)19.4計米丁12.5 μg·L-145.1±3.81)33.6計米丁25.0 μg·L-136.6±4.51)2)46.1計米丁50.0 μg·L-126.3±3.51)61.3LAS 40.0 mg·L-139.3±3.71)42.2

3 討 論

本實驗采用經典的整體動脈血栓形成模型，首次研究了計米丁對實驗性動脈血栓形成的影響，并通過體內、外血小板聚集率的測定初步探討計米丁的抗動脈血栓作用機制。結果表明，大鼠靜脈注射計米丁后呈劑量依賴性延長OT，說明計米丁具有抑制動脈血栓形成的作用。

本研究組曾報道，烏蘇里藜蘆總堿在7.2～42.9 μg·kg-1劑量范圍內，其OT延長百分率為9.2%～95.8%；而計米丁在1.3～20.0 μg·kg-1劑量范圍內，其OT延長百分率為16.4%～66.0%，提示計米丁可能是總堿中抗動脈血栓形成的一種主要有效成分[6]。

本實驗還表明計米丁具有一定的體內、外血小板聚集抑制活性，且呈良好的量效關系。血小板聚集在動脈血栓形成過程中起重要作用，計米丁具有顯著的抗血小板聚集的作用，提示可能與其抗動脈血栓形成作用有關。

計米丁為自烏蘇里藜蘆總堿中提得的一種酯型甾體生物堿，有關其藥理作用，未見文獻報道。作為一種新型的天然藥物，在抗動脈血栓、抗血小板方面，顯示了強大的作用，其有效劑量低至μg級水平，計米丁是烏蘇里藜蘆生物堿中一種重要的抗血栓活性成分，本研究為其作為高效能抗栓藥物的開發提供了廣闊的前景。其分子藥理學作用機制，有待進一步研究。

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