成年大鼠側腦室下區增殖細胞的變化及其關系

臧全金 趙波 賀西京 李浩鵬

傳統觀點認為成年哺乳動物中樞神經系統不可再生，一旦損傷，只能進行瘢痕修復。近年來中樞神經系統存在增殖細胞的發現打破了這一觀點，研究發現在成年哺乳動物體內存在增殖細胞，以側腦室下區（SVZ區）以及海馬齒狀回為最多[1-2]；損傷后，腦組織及脊髓組織生成神經干細胞來對損傷部位進行修復。近年來研究發現星形膠質細胞除了形成膠質瘢痕外，在受到損傷刺激后能夠表達神經干細胞的特異性標記物神經上皮干細胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein)又名nestin蛋白物[3-5]，體外培養能夠形成神經球。星形膠質細胞的增生是否和神經干細胞有關、星形膠質細胞是否能夠表達干細胞的功能尚且不得而知，因此研究損傷后兩者之間的表達變化及其關系有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 側腦室下區神經干細胞的培養 頸椎脫臼處死大鼠，取側腦室下區細胞。機械性分離過濾。酶化學法分離細胞，細胞濃度2×105/ml接種于含bFGF、B27的無血清培養基中。于5%CO2培養箱中培養，觀察換液。對形成的細胞行nestin免疫細胞熒光化學染色鑒定。

1.2 建立腦損傷模型 利用自制的Feeney裝置，自由落體打擊大鼠腦部。

1.3 腦損傷后行免疫組化及免疫熒光染色：成年SD大鼠48只，雌雄各半，200～250g。隨機分為正常組（6只）、假手術組以及模型組（42只）。模型組分為腦損傷后3d、5d、7d、2w、3w、4w組。動物取材前24h由腹腔注射生理鹽水溶解的BrdU，劑量200mg/kg。灌注取材，制作冰凍組織切片。組織切片進行BrdU、GFAP及nestin的免疫組織化學以及GFAP和nestin的免疫熒光雙重標記染色。

1.4 圖像采集 采集側腦室下區5個視野, 測量單位面積BrdU、nestin、GFAP吸光度(A)值的變化。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件包,對BrdU、nestin、GFAP在腦損傷不同時間點側腦室下區中的免疫染色結果進行比較,所有數據用均數±標準差表示。采用單因素方差分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養結果 倒置相差顯微鏡下觀察細胞懸液：細胞呈圓形，體積較小，胞體透明，折光性強。培養后逐漸可見部分懸浮細胞開始分裂。并逐漸形成神經球。神經球行nesin免疫熒光染色鑒定顯示：神經球呈nesin+反應（圖1、圖2）。

2.2 模型建立 應用Feeney模型成功制作出損傷程度較一致的腦損傷模型。

圖1 細胞培養后可見形成神經球

圖2 神經球FITC標記nestin染色陽性

2.3 免疫染色結果 GFAP+星形膠質細胞普遍存在于正常組腦中，但是損傷后細胞腫脹、肥大,突起增多，變長。正常組SVZ區可見少量nestin+細胞，胞體較細小，突起較長，染色較弱。損傷后3d開始染色變深，陽性細胞增多。且在第7d陽性細胞數量最多，從第2周開始細胞數量開始減少。在第4周GFAP+細胞以及nestin+細胞數量逐漸減少至正常水平，細胞形態和正常組相比基本一致。各時間點免疫熒光雙重標記未見有GFAP、nestin雙表達，所見均為單標陽性（圖3）。

圖3 腦損傷后2周SVZ區FITC標記的nestin和TRITC標記的GFAP雙重染色，未見雙重染色細胞，其他各時間點亦未見雙重染色細胞（10×20）

表1 腦損傷后各時間點與正常組、假手術組各指標吸光度（A值）的比較

2.4 統計學結果

如表1所示：腦損傷后3d到2w側腦室下區BrdU、GFAP以及nestin表達與正常組相比都有統計學意義（與正常組比較P＜0.05），損傷后3w GFAP、nestin與正常組相比也具有統計學意義。損傷后4w以及假手術組與正常組相比無統計學意義。

3 討論

正常組和腦損傷后不同時間點的成年大鼠在神經干細胞的培養中都能夠形成克隆球，并且免疫鑒定為nestin陽性。損傷組較正常組較增殖能力弱，形成克隆球的速度明顯快。單細胞克隆法傳代后發現仍然能夠形成神經克隆球，免疫鑒定為陽性，說明具有穩定傳代的能力，具有神經干細胞的增殖特性。損傷后各時間點BrdU陽性細胞明顯增多，并且從側腦室下區向周圍進行遷移，損傷后增殖細胞數量增多，并且向損傷部位進行遷移，可能對損傷修復起重要作用。GFAP陽性細胞在正常即存在于大腦各個部位，在損傷后反應性地增多，與傳統觀點損傷后星形膠質細胞反應性增多相符合。統計學分析發現GFAP陽性細胞在損傷后第3d開始增多，第7d增生最明顯。Nestin為神經干細胞的標記物，陽性說明細胞為神經干細胞。BrdU、GFAP、nestin三者損傷后都較正常組都增多，并且在3、5、7d時增生顯著，7d時最明顯，表明星形膠質細胞和神經干細胞之間可能具有某種關系。應用GFAP和nestin雙重標記損傷后組織，在側腦室下區未見到GFAP+/nestin+雙重標記細胞，說明兩者之間可能存在關系，但不能表明星形膠質細胞表達干細胞的功能。關于星形膠質細胞和神經干細胞之間的關系有2種可能:一種是星形膠質細胞反應性增生，逆向分化表達神經干細胞的功能；另一種可能是神經干細胞部分分化表達星形膠質細胞的功能。這兩者之間的關系尚需要進一步的研究。

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