燈籠草防治小鼠消化道過敏反應的實驗研究

王桂桂 馬延祥

食物過敏是一種較常見的變態反應性疾病，在發達國家已被視為一個主要的健康問題[1]。已有的研究表明，食物過敏輕者可引起皮膚、胃腸道過敏癥狀，重者可致哮喘發作、休克甚至死亡。嬰幼兒期患過食物過敏的小兒，在小學時期的身高明顯低于正常同齡兒[2]。由于食物過敏發病率較高，對人類健康危害性較大，研究食物過敏的病因、發生機制、臨床表現和診斷措施，已成為近年國內外學者十分關注的課題，但有關應用有效藥物積極防治食物過敏的研究，至今尚不多見。為此，我們應用卵清蛋白建立小鼠腸道致敏模型，觀察單味中藥燈籠草對小鼠消化道過敏反應的影響，探尋臨床上能夠有效防治兒童食物過敏的藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與動物 卵清蛋白(ovalbumin OVA)、氫氧化鋁、甲苯胺蘭等（Sigma公司），IgE、ALT、?-干擾素（IFN-?）、白介素5（IL-5）試劑等（上海藍基生物科技有限公司），燈籠草（延邊大學醫學部供應科）。所用儀器均來自延邊大學附屬醫院檢測中心實驗室。生長條件相同、無雞蛋喂養、6～8周齡，體重16～18g，BALB/C♀小鼠(SPF級，延邊大學醫學部)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與藥物制備 將64只小鼠隨機分為正常對照組（Control）、模型組（Model），灌服高、中、低濃度燈籠草預防組（YH、YM、YL組），灌服高、中、低濃度燈籠草治療組（TH、TM、TL組）。按照傳統中藥煎劑制備方法，取燈籠草全草100g，加入500ml雙蒸水，浸泡20min后，加熱煎煮至150ml，用紗布濾去藥渣，再用文火將該煎劑濃縮為100ml的浸膏，分裝于無菌小瓶內，－20℃儲存備用。100g生藥制成100ml定為100%濃度，并將藥物濃度分為高(100%)、中(50%)、低(25%)三個濃度。

1.2.2 建立0VA致敏小鼠模型 基礎致敏：實驗第1天，對Y組、T組和ModeL組的每只小鼠，腹腔注射含有10ug OVA及lmg氫氧化鋁的無菌生理鹽水0.5ml，ControL組腹腔注射等量無菌生理鹽水。強化致敏：實驗第15天，對Y組和Model組每只小鼠，腹腔注射含20ug OVA的無菌生理鹽水0.5m1；Control組腹腔注射無菌生理鹽水0.5m1。激發腸道過敏：實驗第20、25、30天，分別以OVA生理鹽水0.5ml(OVA濃度為50mg/ml)，對Model、Y、T組每只小鼠進行灌胃激發，ControL組小鼠同時以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 給藥 每只小鼠灌服的燈籠草水提物劑量（以下簡稱燈籠草），均按每次0.3ml/10g體重，每日2次，共10d，其中，Y組于實驗前7天開始灌服，T組于實驗開始第20天開始灌服。

1.2.4 標本采集 實驗第30天，摘除小鼠眼球取血，分離血清，放入-70℃的冰箱中保存備用；取完眼球血后，將小鼠四肢固定于案板上，切開腹部皮膚并暴露腹腔組織，取十二指腸Treitz韌帶以下5cm的小腸0.5cm，用冷生理鹽水清洗，再浸入10%福爾馬林中固定，常規石蠟包埋、切片4um，做HE染色和甲苯胺藍染色。

1.2.5 主要觀察指標 血清OVA特異性IgE水平（OD值），采用ELISA法；血清ALT（U/L）檢測采用賴氏法：用UV-8500熒光分光光度劑，于波長505nm處檢測吸光度，制定標準曲線，換算成ALT值；形態學觀察及肥大細胞完整率采用病理顯微圖像分析儀進行小腸粘膜組織形態學觀察與分析；隨機連續計數小腸切片10個高倍視野內的肥大細胞數目，取平均值代表其密度，并同時累計肥大細胞總數及脫顆粒數。IL-5和IFN-?的表達強度對小腸組織病理標本行免疫組化染色(sABC法)，參照Hayashi等標準[3]，將 IL-5和IFN-?免疫組化染色切片的表達強度行半定量評分：0分（細胞未著色）；1分（淺黃色）；2分（淺棕黃色）；3分（棕黃色）；4分：（棕褐色）。

1.2.6 統計學方法 應用SPSS17.0軟件，采用單因素方差和非參數統計分析。計量數據均以±s表示，多組間比較采用LSD法，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

HE染色結果 模型組：小腸絨毛上皮細胞出現局灶性壞死、脫落，固有層明顯水腫、血管充血；TH、TM、YH、YM組：小腸上皮脫落減少，炎癥細胞浸潤較模型組明顯減輕。YL、TL組：小腸炎癥程度與模型組相近。

表1 各組小鼠觀察指標結果（n=8,±s）Table 1 Change of index in mice（n=8, ±s）

表1 各組小鼠觀察指標結果（n=8,±s）Table 1 Change of index in mice（n=8, ±s）

注：Compared with Model group：*P＜0.01;compared with control group: ▲P＜0.01；compared with Y group and T group：■P＞0.05。注：與Model組比較*P＜0.01; 與control組比較▲P＜0.01；Y組與T組比較■P＞0.05。

Groups Integrality of mast cell (%) IgE（OD） IL-5(marks) IFN-?(marks) ALT(U/L)control 84.7±6.79 0.81±0.04 1.47±0.14 1.21±0.04 39.63±3.91*Model 48.6±5.34▲ 1.01±0.03▲ 2.99±0.05▲ 2.91±0.09 79.63±6.82 YH 70.5±6.77*■ 0.86±0.02*■ 2.35±0.02*▲■ 2.33±0.04*▲■ 37.88±3.85*■YM 63.5±3.08*■ 0.87±0.02*■ 2.50±0.04*▲■ 2.43±0.05*▲■ 38.38±3.53*■YL 37.0±4.64▲■ 0.99±0.04▲■ 2.96±0.06▲■ 2.86±0.08▲■ 57.75±7.08*■TH 78.6±4.90* 0.78±0.05* 2.21±0.02*▲ 2.19±0.04*▲ 39.63±2.88*TM 65.4±4.30* 0.83±0.05* 2.33±0.03*▲ 2.28±0.05*▲ 43.00±5.99*TL 38.0±4.36▲ 0.96±0.06▲ 2.81±0.05▲ 2.85±0.06▲ 43.63±6.14*

甲苯胺蘭染色結果 模型、YL、TL組：小鼠小腸固有層肥大細胞聚集，多數肥大細胞胞膜破裂，輪廓不清，并向外排除顆粒；YH、YM、TH、TM組：小鼠小腸固有層肥大細胞聚集及脫顆粒現象較模型組明顯緩解。

各組小鼠觀察指標結果請見表1。

各組間比較結果：小腸肥大細胞完整率（%）：模型組明顯低于正常對照組（P＜0.01）；YH、YM組均明顯高于模型組（P＜0.01）；但Y與T組之間未見顯著性差異（P＞0.05），進一步提示高、中濃度的燈籠草，能夠有效保持肥大細胞的完整，減少肥大細胞脫顆粒，且肥大細胞完整率與燈籠草的濃度有關。

血清IgE水平（OD值）：模型組明顯高于其他各組（P＜0.01）；YH、YM組均明顯高于模型組（P＜0.01）；Y組的IgE水平雖在數值上優于相同濃度的T組，但統計學上未見顯著性差異（P＞0.05）。提示高、中濃度預防組小鼠，血清IgE水平與治療組一樣，均顯著低于模型組，并接近正常對照組的水平。

小鼠腸組織IL-5和IFN-?表達強度：模型組小鼠IL-5和IFN-?含量均明顯升高（P＜0.01）；YH、YM組均明顯低于模型組（P＜0.01）；Y組的IL-5和IFN-?水平在數值上也優于相同濃度治療組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

各組小鼠ALT水平：模型組小鼠ALT水平明顯升高；YH、YM組的ALT水平均明顯低于模型組，差異具有顯著性（P＜0.01）；相同燈籠草濃度在Y組與T組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

對人類健康構成威脅的食物過敏原，主要來自食物中含有的致敏蛋白質、食物加工儲存中使用的食品添加劑和含有過敏原的轉基因食品[4]。目前已知食物過敏的主要影響因素包括：遺傳因素、喂養情況、孕期飲食及吸煙情況，但因為人類食物品種繁多，地區、季節、個人飲食習慣又各不相同，診斷和治療都存在一定困難[5]。

以往的研究結果已證實：某些細胞因子，在食物過敏反應中起重要作用，如：血清特異性IgE水平、嗜酸性粒細胞及組胺含量、肥大細胞釋放的細胞因子或直接引起胃腸效應，或活化狀況（通常以肥大細胞完整率表達）、相關組織中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-?的表達[6]。因此，檢測這些相關的細胞或細胞因子的含量水平，追蹤觀察其變化情況，對于及時診斷食物過敏性疾病和臨床療效的判定，甚至預防作用的確立，都具有較重要的意義。

IgE介導的速發型食物過敏是主要的過敏反應，其顯著特征是：無害的食物過敏原間接引起特異性IgE的產生。肥大細胞參與了腸道粘膜功能的調節，脫顆粒釋放的介質引起炎癥反應，食物特異性IgE常常在尚未出現臨床癥狀前就已經存在。因此，測定血清食物特異性IgE，是目前公認的食物過敏的診斷和預測方法。本實驗成功建立了IgE介導的OVA過敏小鼠模型，并再次證實：模型組小鼠血清特異性IgE水平確實明顯升高，腸道粘膜出現大量肥大細胞聚集、脫顆粒，絨毛上皮細胞局灶性壞死、脫落，固有層明顯水腫、血管充血[7]。

燈籠草為茄科帶萼果實植物，盛產于我國許多地區，民間常用于治療咽喉腫痛、腮腺炎、肺熱咳嗽、泌尿道炎癥等病癥，是采集服用方便、無明顯不良反應的果、藥兩用資源[8]。已有的研究結果表明：燈籠草能夠明顯緩解哮喘小鼠肺和過敏小腸組織的炎癥，對致敏小鼠的免疫性肝損傷具有明顯的保護作用；能夠降低肺組織中IL-5和IFN-r的表達，且存在明顯的量效關系[9-11]。

本研究結果進一步證實，高、中濃度的燈籠草，可以明顯地緩解肥大細胞聚集、脫顆粒現象，緩解小腸炎性。其中，預防組的IgE、ALT、IL-5和IFN-?水平，均明顯低于模型組，肥大細胞完整率明顯高于模型組；預防組的IgE、IL-5和IFN-?水平，在數值上優于相同濃度的治療組；但各個觀察指標在預防組與治療組之間，均未見顯著性差異。

通過復習相關文獻我們認為，高、中濃度的燈籠草降低過敏小鼠IgE水平及IL-5的表達，可能通過調控過敏小鼠體內Th3等調節性T細胞亞群，進而下調體內高水平的IL-5，發揮抗過敏作用。另一方面，燈籠草也可能直接降低腸道通透性，減少了通過腸道與肥大細胞結合的OVA過敏原數量，使IL-5的表達強度明顯低于激發組，從而降低小鼠發生Th2細胞優勢，維持小鼠的Th2/Th1平衡狀態，發揮一定的免疫調節作用。

當食物過敏反應發生時，腸道的通透性增加，仍具有抗原性的食物可被吸收，通過門靜脈進入肝臟而誘發免疫反應，損傷肝臟組織。ALT主要存在于肝細胞中，其活性的高低，是肝功能受損或恢復的特異性指標。本研究發現：高、中濃度的預防組和治療組的ALT水平，均明顯低于模型組，提示燈籠草對免疫性肝損傷具有明顯的預防和保護作用。

綜上所述，高、中濃度的燈籠草，可以明顯緩解小鼠過敏引起的消化道炎癥，預防組緩解消化道過敏性炎變的表現與治療組的作用相似。燈籠草對食物過敏具有明顯地調節和緩解作用，但不能完全預防小鼠的消化道過敏反應。燈籠草可能是用于防治兒童食物過敏的有效藥物，具有較高的臨床研究價值。

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