鹿茸頂端組織IGF1R基因的部分cDNA克隆及差異表達1)

胡 薇 孟星宇 田玉華 劉 寧

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

鹿茸角作為一種哺乳動物器官，它具有兩個獨特的生長特性，即可再生和快速生長。而鹿茸生長發(fā)育機制的研究使它成為一個極其重要的哺乳動物骨質(zhì)器官再生的自然模型［1－2］。鹿茸角生長速度之快是其它哺乳動物組織和器官無法相比的，其生長最旺盛階段每天可長1～2 cm［3］。因此，人們推測其中可能存在特殊的促進骨和上皮組織快速生長的活性物質(zhì)，促進骨質(zhì)和表皮層的增殖。胰島素樣生長因子受體(insulin－like growth factor receptor，IGFR)在動物體的生長發(fā)育過程中起著舉足輕重的作用。胰島素樣生長因子受體有兩種，分別稱為IGF1受體和IGF2受體。IGF2受體沒有IGF的信號傳導(dǎo)功能，可能僅僅是一種清除型受體，其功能在于獲取和降解IGF2。IGF對細胞的作用絕大多數(shù)都是通過與IGF1受體結(jié)合而實現(xiàn)的。而IGF1是一種重要的強有絲分裂原，主要通過IGFR1受體發(fā)揮生物學效應(yīng)，而且兩者必須結(jié)合才能發(fā)揮生物學作用。大量的研究已證明［4］，鹿茸的生長中心位于頂端，該處組織是生長因子和其它很多生理活性成分含量高的部位。馮海華等［5］報道IGF1是一種促細胞分化的生長因子，存在于鹿茸角頂部增殖區(qū)，能促進間充質(zhì)干細胞及軟骨細胞的增殖。而Suttie［6］早前曾發(fā)現(xiàn)，在鹿茸頂部非骨化部位存在大量受體IGF1R，可促進鹿茸細胞的增殖。近些年的許多研究結(jié)果也證明了一些生長因子存在于鹿茸頂部，IGF1和IGF1R可能是影響鹿茸生長速度的主要因素之一。目前，對鹿源IGF1R的研究相對較少，而許多其它動物的IGF1R基因及氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中都相繼被登出。但是，未見有關(guān)梅花鹿IGF1R基因方面的相關(guān)報道。鑒于IGF1R在動物生長軸上的重要作用，本研究將通過IGF1R基因的部分cDNA克隆及在鹿茸頂端不同部位組織的差異表達分析，揭示鹿茸快速生長階段IGF1R對其生長的調(diào)節(jié)作用和規(guī)律，為探索鹿茸再生的機理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮東北梅花鹿鹿茸于2010年6月上旬采自吉林農(nóng)業(yè)大學試驗鹿場1頭3歲齡左右的健康雄鹿，保存于液氮中立即帶回實驗室備用。TRIzoL試劑購自Invitrogen公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ和 PstⅠ、dNTP、DL －2000 Marker購自 TaKaRa公司，Real Master Mix購自長春寶泰克公司。

1.2 樣品制備

鹿茸組織區(qū)別于其他組織和器官的重要一點是生長中心位于頂端，因此，鹿茸的頂端是生長最旺盛的部位。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)和生長特點，可將鹿茸頂端組織大致分為真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層。使用一次性手術(shù)刀在離鹿茸頂端生長點5 cm處垂直鹿茸生長軸方向切斷，切取真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織各100 mg，于液氮保存。

1.3 鹿茸頂端組織總RNA提取及RT－PCR反應(yīng)

按照Trizol操作手冊分別提取真皮、間充質(zhì)、前軟骨和軟骨組織各樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光法檢測總RNA質(zhì)量和含量。以總RNA為模板，以O(shè)ligo－dT為引物(工作濃度為10 μmol/L)，以逆轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 IGF1R基因克隆及序列分析

參照GenBank中相關(guān)序列，設(shè)計IGF1R基因特異性引物(IGF1R上游引物:AAGGAATGAAGTCTG GCTCCG和下游引物:AGGAAGGACAAGGAGACCAAGG)，以軟骨組織cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，并克隆入pMD18－T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆制備質(zhì)粒，并將鑒定正確的重組質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。將梅花鹿IGF1R基因與牛(XM_002696504)、豬(NM_214172)、人(BC143721)、小鼠(BC138869)等物種IGF1R基因CDS區(qū)DNA及氨基酸序列利用Blast分別進行比對分析。

1.5 Real－time PCR法檢測IGF1R基因在鹿茸頂端不同部位組織的表達水平

合成IGF1R基因特異引物(上游引物5'－GCACCATCTTCAAAGGCAATC－3'和下游引物5'－GAGACCAAGGCGTGGGAGT－3')，擴增片段長度為136 bp。以鹿的持家基因actin(GenBank登錄號:AY345228)作為內(nèi)參基因，合成actin引物(上游引物5'－TGACCCTTAAGTACCCCATCGA－3'和下游引物5'－TTGTAGAA GGTGTGGTGCCAGAT－3')，擴增片段長度為85 bp。采用Real Master Mix試劑和7500 Real Time PCR System分析IGF1R基因在真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織中的轉(zhuǎn)錄表達水平。Real－time PCR體系:1 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的 cDNA，上下游引物各5 pmol，10 μL real Master Mix，總體積為25 μL。反應(yīng)條件:94℃激活 DNA聚合酶2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸45 s;進行40 個循環(huán)。隨后做PCR產(chǎn)物的擴增曲線分析，使用StepOne Software v2.1軟件分析IGF1R相對內(nèi)參actin基因的差異表達Ct值(Ct為熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸頂端組織總RNA的提取

各樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可清晰見到28 S、18 S和15 S rRNA各1條帶(圖1)，表明本試驗所提取的鹿茸真皮、間充質(zhì)、前軟骨和軟骨組織總RNA是基本完整的，材料保存和提取過程未發(fā)生RNA降解。

2.2 IGF1R基因的克隆

IGF1R基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳得到1 203 bp左右的1條特異性條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。提取質(zhì)粒，分別用XbaI、PstI雙酶切和PCR鑒定重組質(zhì)粒pMD－18T－ IGF1R(圖3)，從圖3中可看出，均得到了與目的帶大小相符的明顯的電泳帶，表明克隆基本成功。

2.3 IGF1R基因的序列分析

東北梅花鹿IGF1R基因與其它4個物種的DNA和氨基酸序列比對結(jié)果分別見圖4和圖5。其中:梅花鹿IGF1R基因編碼區(qū)部分序列為1203 bp，與牛、豬、人和小鼠核酸序列同源性分別為 98.07%、94.21%、93.94%、88.05%(圖 4);IGF1R蛋白氨基酸序列長度為401個氨基酸，與牛、豬、人和小鼠同源性分別為 98.3%、98.5%、97.8%和 94.5%(圖 5)。

圖1 鹿茸頂端組織總RNA提取結(jié)果

圖2 IGF1R基因的PCR擴增結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD－18T－IGF1R的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 IGF1R基因在鹿茸頂端不同部位組織的差異表達

相對熒光定量PCR結(jié)果顯示:以梅花鹿actin作為內(nèi)源參照基因，在鹿茸頂端間充質(zhì)、真皮、前軟骨和軟骨組織中，IGF1R基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平存在著明顯的差異。其中:在軟骨區(qū)轉(zhuǎn)錄表達水平高于其它部位;其次，由高到低為前軟骨層、真皮層和間充質(zhì)層。見圖6、表1。

圖4 東北梅花鹿、牛、豬、人及小鼠IGF1R基因DNA序列分析

圖5 東北梅花鹿、牛、豬、人及小鼠IGF1R氨基酸序列分析

圖6 鹿茸頂端不同部位組織IGF1R基因的PCR擴增曲線橫坐標為Cycle;縱坐標為ΔRn。

表1 相對熒光定量PCR法檢測鹿茸頂端組織IGF1R基因的表達水平(n=3)

3 討論

近年來，國內(nèi)外學者相繼在鹿茸中發(fā)現(xiàn)了各種細胞生長因子，如胰島素樣生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子，表明鹿茸是一個天然的細胞生長因子庫［7－8］。最近研究表明，鹿茸生長因子不但與鹿茸生長有關(guān)，還與鹿角柄的形成及鹿茸的轉(zhuǎn)化有關(guān)［9］。已知IGF1R為糖蛋白，是一種細胞生長因子受體，廣泛表達于多種細胞的表面，它接受IGF1和IGF2的刺激發(fā)揮促細胞生長、分裂及分化等生理作用［10］，介導(dǎo)IGF1和大部分IGF2的生物活性，維持細胞的最佳生長條件和促進細胞的轉(zhuǎn)化。Elliott［11］曾報道鹿茸頂端存在IGF－1受體，并推測IGF－1R在鹿茸頂部以內(nèi)分泌的方式發(fā)揮其作用。而IGF－1是一類多功能細胞增殖調(diào)控因子，通過與IGF1R受體結(jié)合而發(fā)揮作用，對胚胎發(fā)育和多種細胞的生長增殖都在不同程度上發(fā)揮了積極的生物學功能［12］。因此，IGF1R基因?qū)游矬w的生長發(fā)育具有重要的作用。

目前，鹿的IGF1R基因研究甚少，且cDNA尚未得到克隆，GenBank中關(guān)于梅花鹿IGF1R基因序列沒有任何記錄。本研究根據(jù)牛和豬的IGF1R基因序列設(shè)計引物，通過RTPCR和PCR技術(shù)克隆了梅花鹿IGF1R基因cDNA的部分序列，并與牛、豬、人和鼠4個物種IGF1R基因進行了核苷酸和氨基酸序列的比較分析，結(jié)果表明:該序列與牛、豬的IGF1R基因序列高度同源。

RT－PCR是一種非常敏感的檢測方法，但無論競爭RT－PCR還是內(nèi)源性參比基因RT－PCR定量法，它們均屬PCR終點檢測法，在PCR擴增的指數(shù)期和平臺期產(chǎn)量相差極大，很難對起始模板數(shù)準確定量。熒光定量PCR技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、靈敏度高、重復(fù)性好和定量準確等優(yōu)點，成為基因工程研究中的重要工具，目前已得到廣泛應(yīng)用［13］。本研究利用Real time PCR方法，以梅花鹿actin基因作為內(nèi)源參照基因，對梅花鹿IGF1R基因的4種組織進行了組織相對定量表達分析，結(jié)果表明:IGF1R基因在檢測的所有組織中均有不同程度的表達，該結(jié)果具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，且檢測結(jié)果用拷貝數(shù)來表示起始模板的含量，相對半定量RT－PCR中的比較值更為準確可靠。通過數(shù)據(jù)分析顯示:IGF1R基因在軟骨組織中表達量最高;其次，由高到低依次為前軟骨層、真皮層和間充質(zhì)層。試驗結(jié)果初步表明，IGF1R是鹿茸再生過程中軟骨生長的主要調(diào)節(jié)因子之一。

目前，國內(nèi)外對IGF1R基因的研究主要集中在其與腫瘤的關(guān)系上［14－15］，提示IGF1R和IGF1以自分泌途徑參與腫瘤發(fā)病過程，由于兩者活性增強，促使受體活化水平的提高和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強，進而促進細胞的異常增殖;而鹿茸細胞的增殖速度比腫瘤細胞快30倍。IGF1R基因到底在鹿茸組織中發(fā)揮著怎樣的功能，還需要今后大量的試驗研究去證實。近幾年，筆者在尋找參與鹿茸再生調(diào)控的關(guān)鍵因子方面取得了一定的進展，但是對于鹿茸復(fù)雜的生長調(diào)控機制研究而言，仍然處于初級階段。本研究只是針對IGF1R基因在東北梅花鹿這個物種上進行了初步的探索，為進一步研究IGF1R在鹿茸角快速生長和再生過程中可能具有的重要作用，提供一定參考和可利用的基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)。

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