黃檗葉片內保護酶活性的時序變化1)

何冬明 嚴善春 魯藝芳

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

在自然界，植物要面臨病菌侵染、昆蟲取食等一系列來自外界的壓力，為了適應這種生態壓力，植物形成了復雜的防御體系［1］。其中，過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)都是植物體內重要的保護酶［2－3］，它們可以催化有機物，能夠產生毒害昆蟲的防御物質，從而有效地抵御害蟲的侵襲［4－5］，保證植株健康生長。黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)又稱黃波欏，為蕓香科的闊葉喬木，是東北三大硬闊之一。一直以來很少有關于黃檗病蟲害大發生和危害的報道。在本研究的樣品采集過程中發現，黃檗遭到黃波欏麗木虱(Calophiya nigra Kuwayama)［6］的侵襲，造成大量葉片萎縮潰爛。哈爾濱松樂公園內黃檗人工混交林，麗木虱對其雌、雄株的危害率:7月份，分別為89.46%和67.31%;8月份，分別為65.93%和42.85%;6月份，危害率最低，分別為21.53%和12.97%。東北林業大學哈爾濱實驗林場內黃檗人工混交林，麗木虱對雌、雄株的危害率;7月份，分別為93.62%和75.47%;8 月份，分別為 79.31%和 52.11%;6 月份，危害率最低，分別為30.77%和19.84%。由此可見，黃檗并非能抵御所有害蟲，且不同月份的危害程度有明顯差別。目前，國內外眾多科研工作者對植物抗性與酶活關系的研究，大多是在脅迫條件下分析各種保護酶活性變化［7－10］，而對自然條件下林木保護酶與抗性關系的研究較少，對黃檗的相關研究尚未見報道。本研究主要研究生長時期和健康狀況對黃檗葉片內保護酶活性的影響，探索黃檗組成抗性防御機制，為黃檗人工林的有效管理和害蟲防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗地點選在哈爾濱松樂公園和東北林業大學哈爾濱實驗林場，黃檗均為人工混交林。松樂公園位于黑龍江省哈爾濱市香坊區，黃檗平均樹齡為37 a，郁閉度為0.6左右，林內有白樺、榆樹等喬木，紫丁香、榆葉梅等灌木。東北林業大學哈爾濱實驗林場位于哈爾濱市南崗區，黃檗平均樹齡為56 a，郁閉度在0.7左右，林內有樟子松、蒙古櫟、榆樹等喬木，烏蘇里鼠李、暖木條莢蒾等灌木。2塊樣地立地條件相似。分別在6、7、8月每月月底，在2塊樣地隨機抽取健康和受害的黃檗雌雄各6株，在每株樣樹樹冠的上、中、下3個層次的東、南、西、北4個方向，即12個方位采摘葉片，將同株樣樹上所采摘的葉片充分混合裝入夾鏈袋內，迅速放入冰盒，帶回實驗室放入冰柜中，－40℃保存，待測。

1.2 測定方法

1.2.1 CAT 活性測定

酶液的提取:稱取1.0 g鮮樣，液氮研磨，加入6 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.8);冰浴研磨至勻漿，4℃下，10 000 r/min離心10 min，取上清液為酶提液。

活性測定:參照王晶英的過氧化氫氧化法［11］82－83。取40 μL酶提液，加入2.5mL 0.05mol/L磷酸緩沖液和1mL蒸餾水，設置不加酶液為對照。反應體系在30℃水浴中保溫10 min后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L 的 H2O2，于240 nm 下測定吸光度，以1 min內OD240變化0.1的酶量為1個酶活力單位(U·g－1)。

1.2.2 POD 活性測定

酶液的提取:稱取1.0 g鮮樣，液氮研磨，加入6 mL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液(pH=6.0，每 100 mL 含 0.1 g PVP)，冰浴研磨至勻漿，4℃下，10 000 r/min離心10 min，取上清液為酶提液。

活性測定:參照李合生［12］的愈創木酚法。取100 μL酶提液，加入2.9 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液和 1 mL 0.1 mol/L愈創木酚，設置不加酶液為對照。反應體系在30℃水浴中保溫30 min后，逐管加入1 mL 0.8%H2O2終止反應(測的時候現加)，于470 nm下測定吸光度，以1 min內OD470變化0.01的酶量為1個酶活力單位(U·g－1)。

1.2.3 SOD 活力測定

酶液的提取:稱取1.0 g鮮樣，液氮研磨，加入6 mL 1/15 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.8)，冰浴研磨至勻漿，4℃下，10 000 r/min離心10 min，取上清液為酶提液。

活性測定:參照王晶英的氮藍四唑染色法［11］136－138，略有改動。樣品值(光照):100 μL酶提液加3 mL反應液(0.05 mol/L磷酸緩沖液);最大光化值(光照):100 μL緩沖液加3 mL反應液;對照(暗處;調零):100 μL緩沖液加3 mL反應液。反應體系在4 000 lx日光燈下反應20 min，對照置于暗處，于560 nm下測定吸光度，以將氮藍四唑(NBT)的還原抑制到50%時所需的酶量為1個酶活力單位(U·g－1)。

1.3 數據分析

數據處理使用SPSS16.0軟件，采用Univariate模型對生長時期和健康狀況進行交互效應分析(α=0.05或α=0.01);以One－Way ANOVA(單向方差分析法)和Paired－Sample T Test(配對樣本t檢驗)進行差異顯著性分析，以最小差異顯著法LSD對生長時期和健康狀況的影響進行多重比較分析。所有統計比較n=6。

2 結果與分析

2.1 生長時期及健康狀況對黃檗葉片內保護酶活性的影響

從表1可看出，生長時期對CAT、POD和SOD的活性影響差異均極顯著(p＜0.01)，健康狀況對CAT、POD和SOD的活性影響不顯著(p＞0.05)。

表1 影響葉片內保護酶活性變化的主效應分析檢驗結果

2.2 健康和受害的黃檗葉片內CAT活性的時序變化

從表2中可看出，不同樹齡的健康和受害黃檗雌、雄株葉片內CAT的活性大小依次為7月份、8月份、6月份，且7月份均與6、8月差異極顯著(p＜0.01)，而健康和受害的葉片內CAT活性之間差異均不顯著(p＞0.05)。

表2 不同生長時期健康和受害的黃檗葉片內CAT活性的時序變化 U·g－1min－1

2.3 健康和受害的黃檗葉片內POD活性的時序變化

從表3中可看出，不同樹齡的健康和受害黃檗雌、雄葉片內POD的活性均表現為7月份＞8月份＞6月份。黃檗葉片內POD的活性，37年生的受害雌株及56年生的健康和受害雌株，7月份均與6月和8月差異極顯著(p＜0.01);37年生的健康雌雄株及56年生的健康雄株，6月份均與7月和8月差異極顯著(p＜0.01);37年生和56年生的受害雄株，6月、7月和8月之間差異均極顯著(p＜0.01)。健康和受害的葉片之間，7月份差異顯著(p＜0.05)，而在6月份和8月份差異均不顯著(p＞0.05)。

表3 不同生長時期健康和受害的黃檗葉片內POD活性的時序變化 U·g－1min－1

2.4 健康和受害的黃檗葉片內SOD活性的時序變化

從表4中可看出，不同樹齡的健康和受害黃檗雌、雄葉片內SOD的活性由大到小依次為7月份、8月份、6月份。黃檗葉片內SOD的活性，37年生和56年生的健康雌株，6月份與7月和8月差異極顯著(p＜0.01);37年生的健康雄株、受害雌雄株及56年生的受害雌株，6月、7月和8月份之間差異均極顯著(p＜0.01);56年生的健康和受害雄株，7月份與6月和8月差異極顯著(p＜0.01);健康和受害葉片之間在各個月份差異均不顯著(p＞0.05)。

表4 不同生長時期健康和受害的黃檗葉片內SOD活性的時序變化 U·g－1

3 結束語

植物和昆蟲在長期的協同進化過程中不斷相互作用，彼此形成了許多防御及適應機制［13］。黃波欏麗木虱1 a發生3代，6月為第1代若蟲危害期，7月為第2代若蟲危害期，8月為第3代若蟲危害期，7月下旬，隨著個體數量的不斷增加，若蟲排泄的大量蜜露及由此滋生的煤污病造成60%的若蟲死亡［6］，使第3代若蟲數量大幅度降低。本研究結果表明健康和受害的黃檗葉片內CAT、POD和SOD的活性均表現為7月份＞8月份＞6月份，這種變化與其害蟲黃波欏麗木虱的種群數量變化趨勢相吻合。說明黃檗為抵御麗木虱的危害，在長期的協同進化過程中形成了獨特的隨時序調整抗蟲性的機制。

植物對昆蟲的防御是通過物理防御和化學防御共同實現的［14］，害蟲的脅迫能引起植物生理的應激反應［15］，而應激反應可表現為保護酶活力的變化［16］。本研究結果發現，健康和受害的黃檗葉片內保護酶的活性，POD只有在7月份差異顯著(p＜0.05)，其在6月和8月以及CAT和SOD在各個月份差異均不顯著(p＞0.05)。這說明黃檗誘導抗性機制較差，誘導防御不是其自身保護的主要措施。

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