白楊細胞質遺傳的細胞學機理(Ⅱ)1)——質體和線粒體在生殖細胞和營養細胞中的分布與變化

崔彬彬 楊妮娜 孫宇涵 徐兆翮

(林木育種國家工程實驗室(北京林業大學)，北京，100083)

陳 萍

(保定學院)

馮 慧

(北京市園林科學研究所)

李 云

(北京林業大學)

細胞質遺傳在植物中是指質體和線粒體的遺傳。早在1909年Correns和Baur分別在紫茉莉(Mirabilis jalapa)和馬蹄紋天竺葵(Pelargonium zonale)中就發現了質體的母系遺傳和雙親遺傳現象。此后，很多學者發表了大量的有關被子植物和裸子植物細胞質遺傳的研究結果［1－6］。目前，國內外有關楊樹細胞質遺傳的報道主要以黑楊派(Section Aigeiros)、青楊派為主(Section Tacamahaca)，他們只是用單一的方法對楊屬進行了部分研究［7－11］，對楊樹尤其是白楊派(Section Leuce)細胞質遺傳方式及其機理并沒有很全面、系統的研究。

自2004年起，崔彬彬、李云等［12－14］對白楊派樹種及其三倍體雜種細胞質遺傳進行了系統的研究。以白楊派毛白楊(Poplus tomentosa)、銀白楊(P.alba)、中國山楊(P.davidiana)、響葉楊(P.adenopoda)、新疆楊(P.bolleana)、毛新楊(P.tomentosa×P.bolleana)、銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)、銀毛楊(P.alba×P.tomentosa)8個種及其三倍體雜種為材料，通過不同發育時期花粉細胞學觀察、成熟花粉核酸酶檢測、PCR－RFLP分子標記技術，圍繞質體和線粒體及其DNA在花粉發育過程中的存在狀況、變化規律與遺傳機理進行了研究。同時，對不同親本來源的三倍體毛白楊雜種葉綠體性狀變異進行了分析，檢測是否有細胞質遺傳效應發生，取得一定的進展。本研究主要涉及花粉發育中質體和線粒體在生殖細胞和營養細胞的分布與變化，是白楊細胞質遺傳的細胞學機理研究工作的報道之二。

近年來，由于試驗手段的不斷改進，細胞質遺傳的檢測方法由早期的正反交試驗等經典遺傳學方法到現代的電子顯微鏡技術、分子生物學等技術的綜合應用［6，11，15－16］。遺傳學試驗和分子標記技術使人們對植物細胞質遺傳方式有了廣泛的認識，而細胞學方法能對不同類型細胞質遺傳方式的機理做出更確切的解釋，使細胞質遺傳機理的研究得以迅速深入［16－19］。迄今為止，許多研究者通過細胞超微結構的電鏡觀察，確定質體和線粒體是否在生殖細胞和精細胞中存在，以及是否經過受精作用傳遞到合子中。從而對質體和線粒體傳遞方式及其遺傳機理進行細胞學分析［5，20－21］。本研究應用電子顯微鏡技術，對毛白楊等花粉發育過程中質體和線粒體在生殖細胞和營養細胞的分布與變化進行了觀察，旨在揭示白楊派樹種細胞質遺傳方式和遺傳機理，闡明父系細胞器及其DNA丟失的機理，并填補該領域的研究空白。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取白楊派樹種:毛白楊5041♂(山東冠縣)，毛新楊TB13♂(中國農大家屬院)，銀腺楊2號♂(山東冠縣)，中國山楊8號♂(北京妙峰山);取上述材料不同發育時期的花藥、花粉制作普通光鏡、透射電鏡觀察的樣品，用醋酸洋紅鏡檢確定花藥、花粉發育時期。

1.2 超薄切片的制備與透射電鏡觀察

為了觀察不同時期生殖細胞質體和線粒體的存在狀況，取單核花粉、2－細胞早期花粉、成熟期花粉按下列程序制作電鏡樣品。參考胡適宜［20］、Sodmergen［3］和 Liu［21］的方法，制備樣品時，先用醋酸洋紅染色確定花藥發育時期，然后分別將不同發育時期的花藥或花粉粒收集于2.5%戊二醛溶液中(0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液配制，pH值7.2)，室溫固定4 h，用不含固定劑的相同緩沖液清洗4次，每次15 min，材料轉入1%鋨酸室溫固定1 h后放入冰箱中4℃過夜。次日棄去固定液，固定的材料經清洗4次和系列酒精脫水后，用還氧丙烷過渡后包埋于Spurr環氧樹脂中，包埋后的材料在LKB－V型切片機上用鉆石刀切片，將切片用pH值7.4的TBO染色液復染，在Olympus光學顯微鏡下觀察，確定花粉粒內細胞的輪廓，以區分生殖細胞的細胞質與營養細胞的細胞質。然后用銅網收集切片，1%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛先后染色，清洗后在 JOEL JEM －1010 透射電鏡下觀察和照相［3，21－22］。

2 結果與分析

2.1 質體和線粒體在生殖細胞和營養細胞中的分布與變化

2.1.1 單核花粉

小孢子單核靠邊期，細胞的中央出現了一個很大的液泡，占據了細胞絕大部分的空間，只在細胞的邊緣有一薄層細胞質，在液泡邊緣的細胞質可以觀察到質體和線粒體。凸透鏡狀的細胞核處于貼壁的位置，超微切片電鏡觀察顯示，細胞質內含豐富的質體和線粒體，一般來說質體較大，呈圓形或橢圓形，基質較濃，線粒體較小，呈圓形，具有內嵴(圖1a－b)。

2.1.2 2 －細胞早期花粉

小孢子有絲分裂前，細胞質中的細胞器的分布發生變化，大多移向靠大液泡的一端，質體和線粒體同樣表現明顯的極性化，它們大多分布在將成為營養細胞的一極(圖1c)。當小孢子有絲分裂結束時，產生1個大的營養細胞和1個小的生殖細胞，早期的生殖細胞呈凸透鏡形，一面與花粉壁緊貼著，向著營養細胞的另一面壁較厚，在電子顯微鏡下為透明狀(圖1d－g)。上述細胞器的極性分布導致了在分裂后形成的營養細胞含有大量的線粒體和質體，而在生殖細胞的細胞質中僅有少量的線粒體，缺少質體(圖1d－e)。董源曾在普通光鏡下觀察到毛白楊第1次有絲分裂時多為不均等分裂，成膜體在生殖細胞和營養細胞之間形成一次彎曲的壁。因此營養細胞比生殖細胞大的多，約占整個細胞體積的3/4～4/5。生殖細胞呈凸透鏡形緊靠花粉的一側［23］。崔彬彬等曾利用DAPI熒光壓片在毛新楊、銀腺楊花粉發育過程中也觀察到了這種不均等分裂［14］。(圖1f－g)顯示銀腺楊貼壁期的生殖細胞表現特殊，細胞質中除了線粒體，還有1～2個質體的分布。

2.1.3 成熟期花粉

隨著花粉的發育，營養細胞中液泡變小，在營養細胞中質體轉變成造粉質體，含大量淀粉顆粒。這為材料的固定、樹脂浸透及超薄切片造成了一定的困難，導致質體和線粒體的切片觀察效果不夠理想。生殖細胞貼壁后期，向著營養細胞的壁已開始變薄，核占據細胞很大的面積。細胞質中仍有一定數量的線粒體存在，缺少質體。生殖細胞和營養細胞中質體和線粒體的形態結構與分裂前的小孢子中的相似(圖1h)。生殖細胞脫離花粉內壁，游離于營養細胞中央，細胞變為球形，細胞壁薄并且與營養細胞質界限不明顯(圖1i)，此時在生殖細胞的一個切面上仍可以觀察到線粒體的存在(圖1j)。生殖細胞和營養細胞中質體和線粒體存在的狀況與貼壁時期沒有明顯變化，營養細胞質中開始出現大量的脂體(圖1k)。關于花粉不同發育時期，營養細胞中質體的變化，胡適宜和羅玉英［22］也曾在玉竹(Polygonatum odoratum)雄配子體發育過程中，發現營養細胞中的質體發生明顯的變化:在早期的營養細胞質中，含有豐富的造粉質體;在花粉發育后期，脂體增加而造粉質體消失;接近成熟時花粉富含油滴。

董源在毛白楊花粉超微切片的橫切面觀察到2層同心圓結構的質體［23］。相同的現象也出現在毛白楊5041的成熟花粉中，在營養細胞的細胞質中，質體的內膜系統發達，組成同心環狀結構，而線粒體染色較淺，內嵴發達(圖1l－n)。

在成熟花粉中，生殖細胞和營養核均高度伸長，超微結構觀察發現，生殖細胞2端的細胞質延伸，細胞呈梭形，細胞質中存在電子透明的小泡和線粒體，該線粒體染色較深，內嵴明顯，同樣不存在質體(圖1o－p)。營養核隨著細胞的延長也變為不規則及深的裂瓣，并形成許多凸起，核周圍有線粒體和質體分布(圖1q－r)。董源在毛白楊［23］、袁宗飛在旋花科植物［2］、牛建功在旱金蓮(Tropaeolum majus)［24］中都發現了生殖細胞和營養核的不規則形狀。

2.2 細胞質中質體和線粒體與熒光點關系的鑒定

在DAPI染色壓片下曾經觀察到白楊生殖細胞周圍的細胞器熒光點有2類:一類大而較亮，一類小而較暗［14］。為了鑒定這2類熒光點是否分別代表了質體和線粒體的類核熒光，將熒光觀察過的切片用Spurr環氧樹脂重新包埋，制作電鏡觀察樣品，進行超微結構的觀察。對比熒光點，以及超微結構中質體和線粒體在生殖細胞中的分布位置和大小差異，可以判斷大而亮的熒光點是質體熒光點，小而暗的熒光點是線粒體熒光點。

3 結論與討論

應用電子顯微鏡技術，觀察白楊派樹種毛白楊、毛新楊、銀腺楊、中國山楊花粉發育中質體和線粒體在生殖細胞、營養細胞中的分布與變化。結果表明:質體和線粒體的遺傳是相互獨立的，具體表現為在小孢子第1次有絲分裂時質體由于極性分布，導致早期的生殖細胞細胞質內已不含質體，為白楊派樹種質體母系遺傳提供了確切的細胞學證據;而線粒體在花粉發育過程中一直存在。同時，細胞學觀察發現銀腺楊少數質體被排除的時期相對遲緩。但是，不同發育時期的營養細胞細胞質內含有豐富的質體和線粒體。筆者結合以往的研究工作，對以上結果進行討論。

Hagemann等［25］以4個屬植物為代表提出了在被子植物中父系質體傳遞的4種方式，除天竺葵屬型(Tilney－Bassett type)精細胞含質體并傳遞至合子，被確定為質體雙親遺傳外，其余的番茄屬型(Lycopersion type)、茄屬型(Solanum type)和小麥屬型(Triticum type)3種類型質體在雄性細胞的發育或受精過程中被排除，這是質體母系遺傳的細胞學基礎。本研究結果證明白楊派樹種毛白楊、毛新楊、銀腺楊和中國山楊雄性質體在小孢子有絲分裂時由于極性化分布被排除，導致剛形成的生殖細胞細胞質內不含質體，與番茄屬型的特征一致，而與Russell認為美洲黑楊質體在受精時被排除，把楊樹細胞質遺傳歸為小麥屬型［10］的觀點不同。在白楊派樹種生殖細胞形成和發育各時期雖然均存在線粒體，以往的DNA熒光觀察可以確定線粒體DNA在生殖細胞不同發育時期已降解［14］，這是其母系遺傳的重要機制。這一結果說明白楊的質體遺傳和線粒體遺傳是在相互獨立機制下進行的，類似于Sodmergen［3］，Liu 等［21］的研究結果。

圖1 超薄切片透射電鏡觀察

許多學者認為細胞器的極性分布可能是細胞骨架在起作用［26］。Schr?der［27］在脂麻掌(Gasteria verrucosa)的研究中，推測質體和其它細胞器在胞內的運動和定位似與肌動蛋白微絲有關。Huang等［28］在白花丹(Plumbago)的生殖細胞中觀察到細胞器與微管連結，認為細胞器的極性分布是微管起作用。蔡雪研究朱頂紅(Hippeastrum rutilum)、高原卷丹(Lilium davidii var.Unicolor)花粉粒和花粉管中細胞骨架時發現，正常花粉小孢子不均等有絲分裂是由微管系統決定的，而秋水仙素和高溫(32℃)能影響微管從而導致小孢子的對稱分裂［27］。早期董源觀察鄭州地區和北京地區毛白楊的有性生殖過程時發現，毛白楊單核花粉有絲分裂多不均等，少為均等分裂［23］。本研究發現，白楊派樹種花粉第1次有絲分裂的不均等分裂，使質體被排除在生殖細胞以外，不參與授精過程，是質體母系遺傳的主要原因。秋水仙素人工誘變多倍體原理也是通過抑制紡錘體微管生成，阻止減數分裂時期染色體分離。據此，筆者打算通過進一步的研究工作，搞清幾個問題:①在人工誘變多倍體過程中，秋水仙素、高溫等誘變條件能否抑制微管作用，從而影響包括質體在內的細胞器的極性分布，進而引起細胞質遺傳方式的改變。②在對核基因組實施加倍的同時，是否也導致了細胞質遺傳物質的加倍。筆者等曾經對不同加倍方式所得三倍體毛白楊葉綠體性狀變異進行了研究［13］，發現大部分三倍體毛白楊與二倍體親本在葉綠體大小上差異不大;葉綠體數目則因倍數的增加而增加，其中卵細胞染色體加倍獲得的三倍體達到極顯著水平;在單位體積、單個細胞葉綠體DNA含量方面，花粉染色體加倍獲得的三倍體比卵細胞染色體加倍獲得的三倍體表現突出，其中葉綠體大小與單位體積的個數呈負相關變化，單位體積葉綠體DNA量的增加與葉綠體大小和單位體積葉綠體數目關系不大。以上結果是否與不同加倍方式有關?葉綠體數目的增加是否由于加倍作用引起質體極性化分布異常?花粉染色體加倍導致核基因組加倍的同時，是否也導致了葉綠體基因組的加倍?這些問題今后需要進一步深入研究。

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