進展期胃癌P53蛋白和PCNA/cyclin的表達

趙魯笳，邢廣瑩，王美華，劉天卿

(大連市友誼醫院 病理科，遼寧 大連 116001)

抑癌基因P53定位于人類染色體17P13，其等位基因的缺失和突變在腫瘤的發生、發展過程中起著重要作用。增殖細胞核抗原/細胞周期蛋白(PCNA/cyclin)是一種在細胞G1后期和S早期廣泛表達的核蛋白，它是檢測腫瘤細胞增殖活性的常用指標。本研究旨在探討P53及PCNA表達與腫瘤分化程度的關系，評價其在胃癌診斷及判斷生物學行為和預后中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究材料

大連市友誼醫院1994年1月～1999年12月的進展期胃癌65例。其中，高分化腺癌14例，中分化腺癌20例，低分化腺癌31例。另收集正常胃黏膜5例。患者男 52例，女13例，平均年齡60.4歲。標本經10%甲醛固定，常規脫水浸蠟包埋，連續切片。切片厚4～6μm。試劑: P53(PAb1801),PCNA(PC10),生物素化IgG,LSAB kit均為Dako公司產品。

1.2 方 法

切片常規脫蠟至蒸餾水后 P53行檸檬酸—微波—LSAB綜合技術法免疫組化染色；PCNA行常規LSAB法免疫組化染色，同時用已知陽性切片和TBS替代第一抗體分別作陽性及陰性對照，用Harris蘇木素液復染。

1.3 判斷標準

進展期胃癌分化程度根據傳統病理形態學分為高分化、中分化、低分化Ⅲ級；P53陽性細胞半定量分級參照Galand分級法[1]，整張切片或病變區無著色為0級，陽性細胞數<10%為Ⅰ級，10%～50%為Ⅱ級，>50%為Ⅲ級；PCNA陽性細胞半定量分級參照 Jain′s分級標準[2]，觀察5個具有代表性的高倍視野，按陽性細胞所占比例分為Ⅳ級，即1%～25%為Ⅰ級，26%～50%為Ⅱ級，51%～75%為Ⅲ級，76%～100%為Ⅳ級。其中，Ⅰ、Ⅱ級為弱陽性，Ⅲ、Ⅳ級為強陽性。

1.4 統計學方法

所有標本均由兩名醫師采用雙盲法觀察切片，所得統計學資料行χ2檢驗,P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 正常胃黏膜P53與PCNA的表達

P53和PCNA陽性表達均定位于細胞核，呈黃棕色，為顆粒型或彌漫型。正常胃黏膜P53蛋白不表達，為陰性。PCNA主要表達在胃腺中下部的細胞增殖帶，黏膜表面上皮細胞為陰性，黏膜固有層內淋巴濾泡生發中心細胞多為陽性。

2.2 胃癌中P53蛋白與PCNA的表達

進展期胃癌標本65例中有35例(53.85%)有P53蛋白的表達。其中，18例P53蛋白呈過度表達，占陽性標本的51.43%，主要表達在分化較差的腫瘤細胞增殖區，P53染色定位于細胞核，分布呈異質性(圖1、2)。65例胃癌大部分均有明顯的PCNA表達，Ⅰ級1例(1.54%)，Ⅱ級7例(10.77%)，Ⅲ級24例(36.92%)，Ⅳ級33例(50.77%)。癌中PCNA陽性細胞成簇出現(圖3、4)。癌旁黏膜不典型增生PCNA呈不同程度的表達,部分癌巢周圍間質中浸潤的淋巴細胞、增殖的纖維母細胞也呈PCNA陽性表達。

2.3 P53蛋白和PCNA表達強度與癌組織分化程度的關系

高分化癌14例，P53陽性率為42.86%，中分化癌20例，P53陽性率為55.00%，低分化癌為31例，P53陽性率為58.06%。胃癌的分化程度與 P53陽性率之間差異無顯著性意義(P>0.05)，但是P53陽性表達率隨著癌分化程度的降低而逐漸增強(分別為21.43%、25.00%、32.26%)，見表1。大部分癌組織(87.69%)均有PCNA的過度表達，胃癌的分化程度與PCNA陽性率之間差異有顯著性意義(P<0.05)，隨著癌分化程度的降低PCNA陽性表達強度逐漸進一步增強，見表2。

2.4 癌組織中 P53蛋白和PCNA表達的比較

進展期胃癌65例中,P53和PCNA均陽性35例；P53陰性但PCNA陽性30例；PCNAⅠ～Ⅱ級8例，P53陽性3例，陰性5例；PCNA Ⅲ級24例，P53陽性14例，陰性10例；PCNA Ⅳ級33例，P53陽性20例，陰性13例。隨著胃癌惡性程度的增高，P53、PCNA的表達強度均隨著相應增高，兩者呈平行關系。

3 討 論

腫瘤抑制基因 P53在腫瘤的發生、發展中起著重要作用。目前的研究表明，50%以上的人類腫瘤有P53基因突變。基因產物為 P53蛋白，由393個氨基酸組成，能與特異的DNA序列結合并且激活轉錄[3]。點突變是P53基因失活的一種方式，正常情況下，細胞內野生型P53的表達水平很低，用一般的免疫組化方法很難檢測到，只有當 P53基因發生突變時，其蛋白產物才高度表達。因此，一般認為，用免疫組化方法檢測出 P53陽性表達即表示有 P53基因突變的發生。本研究應用檸檬酸—微波—LSAB法免疫組化技術對65例進展期胃癌標本進行 P53標記，結果顯示P53的陽性檢出率為53.85%。其中，18例有 P53蛋白的過度表達，而且P53表達強度隨著癌分化程度的降低而逐漸增強。雖然，各級癌組織 P53陽性率差異無顯著性意義(P>0.05)，但作者認為 P53表達強度與癌組織分化程度有其內在聯系。Nigro 等[4]認為P53突變發生與腫瘤的形成過程中，其突變產物可能通過與野生型產物結合產生優勢陰性效應(dominant negative effect)從而使 P53功能失活。當野生型等位基因更進一步丟失時，只剩下突變的等位基因，腫瘤細胞表現為排列紊亂，極性消失，增殖旺盛，速率加快，惡性程度增高，使其更具浸潤性及轉移性。本研究結果也支持這種假設。本研究在65例進展期胃癌中發現有18例呈 P53的過度表達，而且大部分為中、低分化癌(>83.33%)，說明P53 基因突變不僅發生于腫瘤的形成階段而且主要發生在腫瘤細胞的發展階段即進展期。本文結果提示，隨著腫瘤細胞生物學活性的增強,P53基因突變及產物 P53蛋白的積聚和表達也穩定增加并始終貫穿于胃癌發生、發展的整個演進過程。

圖1 胃中分化管狀腺癌，P53表達陽性 LSAB法200×

圖2 胃低分化腺癌,P53表達強陽性 LSAB法200×

圖3 胃中分化管狀腺癌,PCNA表達陽性 LSAB法200×

圖4 胃低分化腺癌，PCNA表達強陽性 LSAB法400×

表1 P53蛋白表達強度與胃癌分化程度的關系

表2 PCNA表達強度與胃癌分化程度的關系

增殖細胞核抗原(PCNA/cyclin)是原位檢測腫瘤細胞增殖活性的免疫標記物，許多研究證明PCNA合成和表達與細胞增殖狀態相關[5]。關于腫瘤生長速度與分化程度及轉移的關系，目前亦有不同觀點。有研究者認為，PCNA陽性細胞的多少能反映腫瘤生長速度及惡性程度，預示腫瘤轉移危險及患者的存活時間[6，7]；相反的觀點認為腫瘤生長速度僅反映當前階段腫瘤發展的狀態，僅與腫瘤細胞動力學有關，而與腫瘤組織的分化程度無必然聯系[8]。本研究中，PCNA在正常胃黏膜表達弱而規律，僅限于胃腺中下部的細胞增殖帶范圍，在胃癌中PCNA表達的陽性細胞數明顯增多。作者常觀察到灶狀的陽性細胞密集區，過度表達的陽性細胞數>80%，PCNA表達在高、中分化癌中有一定的分布規律，而低分化癌內PCNA陽性細胞則呈彌漫性無規律分布。分布呈異質性，說明其增殖活躍并與正常組織相差甚遠，提示癌細胞生長失控， DNA合成紊亂，同時反映腫瘤增殖細胞群中并非所有細胞均同步增殖。在癌間質中部分浸潤的淋巴細胞及增生的纖維母細胞表現為PCNA陽性，說明癌細胞除了自分泌腫瘤生長因子引起自身增殖外，還可以通過旁分泌作用刺激周圍細胞增殖[9]。

本研究結果顯示，PCNA陽性分級與胃癌分化程度差異有顯著性意義(P<0.05)。癌組織分化程度越低，PCNA表達的陽性細胞數就越多，表達強度越強，反映出腫瘤細胞增殖活性和分化程度的一般規律。本組中 P53的陽性表達程度與PCNA的表達呈平行關系，并有明確的量的概念，更能反映出腫瘤細胞的增殖活性與分化程度的關系，說明癌細胞增殖旺盛，增殖速率加快，P53和PCNA的過度表達增加了腫瘤惡性轉化的危險性。因此，采用原位檢測進展期胃癌中P53蛋白和PCNA的表達，比傳統依據病理形態學和分化程度來判斷腫瘤細胞生物學活性和惡性程度更為客觀、可靠，且簡便易行，對判斷預后指導治療有一定意義。

參考文獻:

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