GRP94表達在肺癌細胞對VP-16化療耐藥中的作用

張黎川，王佳瑞，孟 強，李恩成，王 琪

(1.大連大學 附屬中山醫院 呼吸內科，遼寧 大連 116001；2.大連醫科大學 研究生院，遼寧 大連 116044；3.大連市第五人民醫院 腫瘤內科，遼寧 大連 116021；4.大連醫科大學 附屬第二醫院 呼吸內科，遼寧 大連 116027)

中國是肺癌的高發國家，近十年肺癌的發病率分別占男性和女性惡性腫瘤的第一和第二位?；熢诜伟┑闹委熤邪l揮著重要的作用[1]。然而，化療耐藥仍然是導致肺癌化療失敗的主要原因。化療的耐藥性涉及多種機制，除了與腫瘤的基因類型有關外，還與腫瘤細胞的微環境密切相關[2,3]。在腫瘤組織中，由于血供不足及營養條件差等原因，存在低糖、缺氧及酸中毒的微環境。而這些應激條件可誘導一組被稱為糖調節蛋白(Glucose Regulated Proteins,GRPs)的應激性蛋白質合成[4,5]。其中，研究較多的一種是分子量為94 kD的GRP94[6-8]。作為一種分子伴侶，它能夠保護正常細胞，維持內質網的穩定，促進細胞正常生長。而在腫瘤細胞中GRP94的誘導則可能作為潛在的導致腫瘤細胞耐藥的因素[9,10]。

研究表明，GRP94在多種腫瘤細胞包括肺癌中呈高表達狀態[11-13]。GRP94的高表達與細胞的轉化及致瘤性有關，它可以降低腫瘤細胞對X光照射的敏感性[14]。而抑制GRP94的表達，則能夠提高腫瘤細胞對抗癌藥足葉乙甙(VP-16)的敏感性[15,16]。但是，目前對GRP94與肺癌耐藥關系的研究頗少。本研究旨在用RT-PCR、免疫熒光細胞化學等技術，檢測在Ca2+拮抗劑A23187誘導下， GRP94在人肺癌細胞SPCA1中的表達，并探討其表達在肺癌細胞對VP-16耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

人肺腺癌標準細胞株SPCA-1(購自上海生科院細胞研究所的美國ATCC細胞)、RPMI-1640培養基(Sigma公司)、A23187(北京中山生物公司)、VP-16(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)、多克隆羊抗GRP94抗體(美國Santa Cruz公司)、異硫氰酸熒光素(美國Santa Cruz公司)、MTT(Amresco公司)，DMSO(Sigma 公司)。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養：將SPCA1細胞在含有10%小牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640培養基中，置于37℃、含5%CO2的孵箱中無菌培養。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取指數生長期的SPCA1細胞，以5×106/mL細胞接種于培養皿中。細胞長至80%融合時，棄去培養基，用PBS液洗2次，待用。

1.2.2 細胞分組與處理：將1×106個細胞接種于100 mL的培養瓶中培養24 h后，倒掉培養液。再將細胞加入含有不同濃度A23187(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)的新鮮培養液，再培養24 h(A23187濃度為0作為對照組，其它各處理組為實驗組)。然后采用RT-PCR方法檢測各組細胞GRP94在核酸水平的表達。應用免疫熒光細胞化學的方法檢測在A23187濃度為(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)時GRP94的蛋白表達。

1.2.3 RNA提取以及RT-PCR：按Trizol試劑說明書分別提取各組細胞的總RNA，取2 μL溶液，應用分光光度儀測RNA濃度及純度。制備cDNA，進行PCR產物擴增。GRP94mRNA上游引物序列為5′CAGTTTTGGATCTTGCTGT 3′，下游引物序列為5’GTATCCTCTTCACCAGTTGG 3’；內參β-actin上游引物序列為5’TCGTCACCAACTGGGACGACATGG 3’，下游引物序列5′CAGCTGTAGATTCCTTTGC 3′。取PCR擴增產物10 μL，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用美國UVP凝膠成像系統EC3 System進行掃描分析，計算公式為：某樣品GRP94 mRNA的相對表達水平=樣品GRP94的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.4 免疫熒光細胞化學：將各組細胞以固定液(冷甲醇∶丙酮=1∶1)固定15 min，然后用0.1%PBST沖洗3次。加入一抗(羊抗人GRP94多克隆抗體)，4℃過夜。PBS沖洗后，加入二抗(FITC標記的兔抗羊抗體)，閉光，室溫下放置1 h后甘油封片。熒光顯微鏡照相觀察熒光出現的位置及強度。

1.2.5 MTT法檢測各組細胞在化療藥物作用下的生存：取對數生長期SPCA1細胞系的各組細胞，分別以1×104個/孔的密度接種于96孔培養板，每孔加200 μL培養基，置于5%CO2、飽和濕度的37 ℃孵箱培養24 h。加入不同濃度的VP-16至終濃度分別為0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L，每個濃度設3個孔，繼續培養VP-16組48 h后，再向各孔加入MTT 20 μL，4 h后加入DMSO，酶標儀上選擇波長490 nm，檢測各孔IOD值，計算細胞生存率。細胞生存率=(實驗組IOD值-空白對照組IOD值/(對照組IOD值-空白對照組IOD值)×100%。應用Modified Kaber method法求出細胞的半數抑制濃度( IC50),并求得耐藥指數。耐藥指數(RI)=IC50實驗組/IC50對照組。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 GRP94核酸水平的表達

不同濃度A23187(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)誘導后GRP94 mRNA的相對表達量如圖1所示。在A23187誘導下，GRP94 mRNA表達水平逐漸提高，并呈現一定的濃度依賴性，即當A23187的濃度為0.5～6 μmol/L時，與對照組相比， GRP94 mRNA分別提高了0.7～4.3倍。

2.2 GRP94蛋白水平的表達

FITC染色后熒光顯微鏡下觀察發現：在488 nm激發光的激發下，GRP94主要表達在細胞核周圍，呈環形分布。與對照組相比，實驗組細胞(A23187誘導)的熒光強度均有明顯增強，且隨A23187濃度提高綠色熒光逐漸增強。即在A23187誘導下GRP94的表達較對照組明顯升高，與A23187呈一定的濃度依賴性。當A23187濃度6 μmol/L時，GRP94熒光強度最大。見圖2。

圖1 SPCA1細胞培養24 h后，不同濃度A23187處理后各組細胞GRP94的mRNA表達水平

圖2 A23187誘導后，SPCA1各組細胞GRP94蛋白表達

2.3 細胞生存率的檢測

為了研究GRP94的誘導表達能否對SPCA1細胞與VP-16的耐藥性產生影響，本研究比較了不同濃度A23187(0、0.5、1、1.5、2、4、6 μmol/L)誘導下細胞的生存率。結果顯示：隨A23187濃度的升高，細胞的IC50值逐漸升高，各處理組與對照組IC50值比較差異均有顯著性意義(P<0.05)，除了0.5 μmol/L與1 μmol/L A23187處理組及1 μmol/L與1.5 μmol/LA23187處理組間差異無顯著性意義(P>0.05)外，A23187濃度為0、1、2、4、6 μmol/L處理組組間IC50差異均有顯著性意義(P<0.05)。Pearson相關提示：SPCA1各組細胞mRNA表達與相對應VP-16的IC50值之間呈正相關(r=0.78，P<0.05)。SPCA1細胞對VP-16耐藥性增加與GRP94上調有關。見圖3。

圖3 A23187誘導后，SPCA1各組細胞對VP-16的生存率

3 討 論

無論是內在的因素還是外在的作用條件，均使腫瘤細胞容易遭受內質網應激的影響[17]。GRP94是一種研究較多的內質網應激反應蛋白，也是最廣泛的內質網糖基化蛋白，它與熱休克蛋白90(HSP90)有50%的同源性[13]。GRP94具有多種功能，作為與鈣結合的分子伴侶，它們主要參與蛋白質的折疊和轉運。各種應激條件如葡萄糖缺乏、蛋白錯誤折疊、蛋白糖基化及一些誘導劑(如Ca2+-ATPase抑制劑Thapsigargin)都可以激活GRP94的轉錄基因，誘導產生GRP94[17,18]。研究發現，GRP94的高表達是腫瘤進展以及預后不良的標志[19]。此外，GRP94在肺癌組織中呈高表達狀態與腫瘤的分化及進展也有關[12]。作為具有抗凋亡作用的分子伴侶，GRP94與腫瘤的致瘤性及保護性免疫有關[20,21]。

本研究表明：A23187可以明顯誘導人肺腺癌細胞系SPCA1中GRP94的表達，于核酸和蛋白質水平的表達均在一定范圍內隨誘導劑呈濃度依賴性增高，其原因可能是A23187可以通過干擾Ca2+穩態失衡、激活GRPs的轉錄，導致內質網鈣的缺失而誘導GRPs的產生[18]。

作者早期報道了人類肺鱗癌細胞SK-MES-1在誘導劑A23187作用下GRP94的表達上調與該細胞對VP-16的耐藥有關[10]。目前，在人類肺癌中，肺腺癌發病率有增加趨勢，尤其在青年男性，各年齡段的女性以及非吸煙者中多見[22]。因此，本研究選擇人肺腺癌細胞系SPCA1作為研究對象。Dong等[23]在對DOX、VP-16以及TAX等藥物耐藥的乳腺癌細胞的研究中發現，耐藥細胞的GRP94的表達水平高于非耐藥細胞。本實驗結果顯示：A23187誘導組的GRP94表達增高的細胞對VP-16的IC50值也明顯高于對照組。根據各組細胞IC50以及GRP94表達的變化趨勢，可以推斷：GRP94表達能夠增加SPCA1細胞對VP-16的耐藥性，并且其耐藥性與GRP94表達的程度有關。然而，GRP94增加細胞對化療藥物的耐藥性機制目前還不十分明確。Pan等[24]發現抑制GRP94表達能增加Panc-1 細胞在放線菌素D作用下的凋亡率。也有研究報道，GRP94能夠降低SH-SY5Y的死亡率，并且能減少缺血再灌注損傷條件下神經細胞的死亡[25,26]。在另一項研究中，鈣蛋白酶II介導的GRP94的水解能增加胃癌細胞的凋亡率[27]。在本研究中，GRP94誘導表達明顯增高的細胞組的生存率較GRP94表達低的細胞組明顯增加，提示具抗凋亡作用的GRP94對肺癌細胞也具有保護作用，可能參與肺癌的耐藥。關于GRP94表達與肺癌耐藥的關系值得進一步研究。

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