帕金森病小鼠和大鼠模型黑質紋狀體中膽綠素還原酶B的表達

周冰瑩，趙 欣，孫 泓，姜 堯，蒲小平

(北京大學1.天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室、2.藥學院分子與細胞藥理學系，北京 100191)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種由于黑質部位多巴胺能神經元選擇性、進行性的變性、缺失，導致黑質－紋狀體多巴胺神經系統失調，而引起的神經退行性疾病［1］。PD典型臨床癥狀包括肌肉僵直、靜止性震顫、運動遲緩以及姿勢反射障礙等。PD的致病因素仍不十分清楚，目前研究認為與年齡老化、遺傳易感性和環境毒素等導致的神經元死亡等因素有關。然而，已有的研究表明［2］，氧化應激在多巴胺細胞死亡中起關鍵作用，是PD的發病機制之一。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺生物合成中的限速酶。在PD腦組織中，TH表達含量明顯下降，表明多巴胺能神經元的數目減少，因而TH已成為PD實驗模型建立成功的指標之一。

膽綠素還原酶 B(biliverdin-Ⅸβ reductase，BVRB)，也稱黃素還原酶，存在于細胞質，在胎兒肝臟及成人紅細胞中高表達，且在心臟、腎臟、大腦、肺臟及腎上腺均有分布［3－4］，是體內氧化還原循環的重要成員之一。膽綠素還原酶是催化膽綠素還原成膽紅素的關鍵酶，而膽紅素具有明顯的抗氧化的生理功能。本實驗室前期在MPTP誘導的PD小鼠模型蛋白質組學研究發現，與對照組小鼠相比，模型組小鼠黑質紋狀體中BVRB的含量明顯增高，約為2.30倍［5］。本實驗旨在用 MPTP和6-OHDA分別制備PD小鼠和大鼠模型，探討BVRB在黑質紋狀體內的表達變化。

1 材料與方法

1.1動物C57BL/6小鼠，♂，體質量20～25 g;SD大鼠，♂，體質量200～300 g，均由北京大學醫學部實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SYXK(京)2006-0008。動物分籠飼養，室溫和濕度分別維持在(22±2)℃和(55±5)%，明暗周期12 h，自由進食，飲水不限。實驗前適應環境1周。

1.2試劑MPTP和 6-OHDA(美國 Sigma-Aldrich公司);TH抗體(美國Millipore公司);β-actin抗體和BVRB抗體(美國Santa Cruz公司);HRP標記的二抗(中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3動物PD模型的建立

1.3.1MPTP小鼠模型小鼠適應環境1周后，隨機分為2組，即對照組(n=12)和模型組(n=12)。模型組腹腔注射MPTP(30 mg·kg－1，溶解于生理鹽水)，對照組給予等體積生理鹽水，連續5 d，每天給藥1次，最后一次給藥后d 4處死小鼠，冰上取腦分離黑質和紋狀體，于－80℃保存，用于分別測定多巴胺及其代謝產物的含量和進行Western blot分析［6］。

1.3.26-OHDA大鼠模型大鼠適應環境1周后，觀察確認無旋轉行為后，隨機分為2組，即對照組(n=12)和模型組(n=12)。麻醉大鼠。以頭顱平位固定于大鼠腦立體定位儀上，消毒后于剪毛處沿大鼠腦頭蓋骨正中線切口，參照大鼠腦立體定位圖譜確定右側紋狀體注射點，坐標如下:前囟前0.5 mm，正中線右1.5 mm，硬腦膜下4.5 mm;前囟后0.5 mm，正中線右 2.5 mm，硬腦膜下 4.5 mm［7］。用電動顱骨鉆小心鉆開顱骨，用5 μl微量注射器每孔注射6-OHDA 溶液2.5 g·L－1(溶于2 g·L－1抗壞血酸注射用生理鹽水溶液)，注射速度為1 μl·min－1，停針 5 min后退針，退針速度為 1 mm·min－1，以防藥液溢出。外科手術方法縫合皮膚，并將術后大鼠置于安靜保溫處單籠飼養直至清醒，連續注射青霉素1周，劑量為每日100萬U·kg－1，自由進食，飲水不限。對照組大鼠每孔用等量溶劑(2 g·L－1抗壞血酸注射用生理鹽水溶液)代替6-OHDA溶液注射，其他操作方法與模型組相同。造模4周后處死大鼠，取腦，冰上分離黑質和紋狀體，于－80℃保存備用，用于分別測定多巴胺及其代謝產物的含量和Western blot分析。

1.4指標測定及方法

1.4.1小鼠滾筒實驗于給藥結束后d 2進行滾筒實驗(SD-2小鼠滾筒儀)，本實驗用來評價小鼠的運動協調能力［6］。測試前訓練2 d，每天2次，轉速為12 r·min－1，訓練時間120 s。正式實驗時轉速調為25 r·min－1，記錄每只小鼠從滾筒開始旋轉到離開滾筒的時間作為小鼠運動潛伏期，測試時間為120 s。每只小鼠重復測定3次取平均值。

1.4.2大鼠阿樸嗎啡誘導的旋轉行為手術4周后，皮下注射阿樸嗎啡(0.5 mg·kg－1)誘發其旋轉行為。注射阿樸嗎啡15 min后，觀察大鼠的旋轉情況。記錄各大鼠在開始旋轉后30 min內的旋轉圈數。PD模型造模成功標準為恒定左旋，平均速度≥7 r·min－1。

1.4.3高效液相 －電化學(HPLC-EC)分析取凍存紋狀體，1 ∶10 加入 100 μl溶液 A(0.4 mol·L－1HClO4)冰浴超聲勻漿，4℃靜置1 h，離心15 min(15 000×g，4℃)，取上清加入 40 μl溶液 B(20 mmol·L－1檸檬酸鈉，300 mmol·L－1K2HPO4和 2 mmol·L－1Na2EDTA)，充分混勻后 4℃靜置 1 h，再離心15 min(15 000×g，4℃)，得到樣品上清，經0.2 μm濾器過濾后，分析多巴胺及其代謝產物3，4-二羥基苯乙酸 (3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量。C18柱流速 1.0 ml·min－1，溫度(24 ± 1)℃，進樣量 10 μl，多巴胺含量用 μg·g－1濕組織重表示［6］。

1.4.4Western blot實驗取凍存黑質紋狀體，1∶7 加入勻漿緩沖液〔80 mmol·L－1Tris-HCl(1 mol·L－1，pH 7.4〕，150 mmol·L－1NaCl，2 mmol·L－1Na2EDTA，1 g·L－1SDS，0.4 mmol·L－1DTT 以及蛋白酶抑制劑)，制備勻漿，冰浴30 min后，離心30 min(15 000×g，4℃)，取上清液，用BCA試劑盒蛋白定量，100℃變性5 min，經SDS-PAGE分離后，恒流230 mA轉移到PVDF膜上，50 g·L－1脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入TH抗體(稀釋比例1∶3 000)4℃孵育過夜，次日加入HRP標記的二抗，37℃孵育2 h，ECL發光液發光，X 線片顯影、定影［8］。為確保蛋白上樣量一致，我們還對內參蛋白β-actin進行了Western blot分析(稀釋比例1∶1 000)。黑質紋狀體BVRB表達的檢測與上述操作方法相同，僅所使用抗體不同(稀釋比例1∶200)。

1.4.5統計學分析所有數據均以±s表示，對于MPTP小鼠數據，采用t檢驗進行組間比較;對于6-OHDA大鼠數據，采用One-way ANOVA進行兩兩比較。

2 結果

2.1小鼠滾筒實驗滾筒實驗的結果見Fig 1。與正常對照組(57.83±23.83)s相比，MPTP模型組小鼠在滾筒上的停留時間(17.40±4.265)s下降(P＜0.05)，表明其運動協調能力降低。

Fig 1 MPTP treatment reduced the latent period(time on the rotarod)of mice in the rotarod test(±s)

2.2阿樸嗎啡誘導的大鼠旋轉行為皮下注射阿撲嗎啡后，大鼠應出現恒定左轉，即旋轉時以左側后肢為支撐點，頭尾相接呈環狀。發生旋轉的模型組大鼠平均旋轉圈數為(7.25±0.77)r·min－1。取發生旋轉速度≥7 r·min－1的大鼠作為6-OHDA帕金森大鼠模型，進行后續的TH和BVRB免疫印跡分析。

2.3PD模型紋狀體內多巴胺及其代謝產物含量的變化HPLC定量分析結果表明，與對照組相比，MPTP模型組小鼠紋狀體內多巴胺水平下降了93.99%。另外，DOPAC和 HVA含量分別下降88.40%和51.19%(均為P＜0.01，Tab 1)。與對照組相比，6-OHDA大鼠損毀側紋狀體中DA水平降低了99.53%;與非損毀側相比，降低了99.32%。此外，與對照組和非損毀側相比，損毀側的DOPAC和HVA含量分別下降了97.89%和89.52%，以及98.09%和90.91%。與對照組相比，非損毀側的多巴胺含量減少了30.02%(均為P＜0.01，Tab 2)。

Tab 1 MPTP effects on dopamine and its metabolites，DOPAC and HVA，in mouse striatum

Tab 2 6-OHDA effects on dopamine and its metabolites，DOPAC and HVA，in rat striatum

2.4PD模型中TH的表達變化與對照組相比，MPTP模型組小鼠黑質紋狀體內TH水平降低了59.69%(P＜0.05，Fig 1)。類似地，與對照組相比，6-OHDA模型組大鼠損毀側黑質紋狀體內TH表達水平減少了73.92%(P＜0.05，Fig 2)。此外，與非損毀側相比，損毀側TH表達水平下降了77.75%(P＜0.05，Fig 2)。

2.5BVRB含量在PD模型黑質－紋狀體系統中的表達與對照組相比，MPTP模型組小鼠黑質紋狀體內 BVRB水平升高了71.70%(P＜0.05，Fig 3)。6-OHDA模型組大鼠損毀側黑質紋狀體BVRB含量為對照組的約2.30倍(P＜0.05，Fig 4)，而損毀側的BVRB水平為非損毀側的約2倍(P＜0.05，Fig 4)。

Fig 2 Western blot analysis of TH in nigrostriatal tissue from control and MPTP treated mice(±s，n=3)

Fig 3 Western blot analysis of TH in nigrostriatal tissue from control and unilateral 6-OHDA lesioned rats(±s，n=3)

Fig 4 Western blot analysis of nigrostriatal BVRB in control and MPTP-treated mice(±s，n=3)

Fig 5 Western blot analysis of nigrostriatal BVRB in control and unilateral 6-OHDA-lesioned rats(±s，n=3)

3 討論

PD是第二大神經退行性疾病，其主要病理改變為黑質致密部多巴胺能神經元的變性和壞死，導致神經遞質多巴胺的不足，最終造成PD特有的運動功能障礙。PD的發病機制至今沒有完全闡明，被認可的觀點有線粒體功能障礙以及氧化應激［9］。

MPTP及其代謝產物MPP+都是線粒體復合物I抑制劑，MPTP在腦內經單胺氧化酶 B轉變為MPP+，由多巴胺轉運體選擇性地攝入黑質多巴胺能神經元內，抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性，使得ATP生成減少，促進自由基生成和氧化應激反應，導致多巴胺能能神經元變性死亡［10］。6-OHDA通過和多巴胺競爭，可與高親和力的多巴胺轉運體結合進入黑質紋狀體多巴胺能神經元，并迅速被氧化形成H2O2、超氧化物等活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，生成的大量ROS超出了多巴胺能神經元自身抗氧化清除的能力，從而發揮細胞毒性作用［11］。因此，用 MPTP和6-OHDA制備的 PD模型中均存在氧化應激機制。

BVRB是一個分子量為21 ku的蛋白單體，其作用底物有膽綠素-Ⅸβ，-Ⅸγ和-Ⅸδ，但不包括膽綠素-Ⅸα。BVR是氧化還原循環的重要組成部分。在生理狀態下，血紅素在血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)的催化下，形成膽綠素、一氧化碳和游離鐵。膽綠素進一步由膽綠素還原酶還原成膽紅素，后者的抗氧化能力比前者強。據研究報道，膽紅素能保護細胞免受耐受值1萬倍以上的H2O2的損傷［12］。此外，BVR還介導 HO-1的細胞保護作用［13］。BVRB的主要作用則是在胎兒發育早期催化血紅素的分解代謝，即它催化膽綠素-Ⅸβ還原成膽紅素-Ⅸβ。BVRB生物功能的研究仍處于起步階段。目前，還未見BVRB在PD模型中的表達變化的相關報道。

本研究主要發現并驗證了兩種PD模型黑質紋狀體系統BVRB的表達變化。MPTP帕金森小鼠模型結果與以往報道的結果一致［5］，與正常組相比，模型組BVRB表達明顯升高。進一步，我們在6-OHDA帕金森大鼠模型中通過Western blot的方法研究了BVRB的表達。結果顯示，6-OHDA帕金森大鼠損毀側黑質紋狀體BVRB的表達較非損毀側和對照組均明顯增高。BVRB表達水平的升高可能是機體對抗腦內氧化應激的一種補償機制。BVRB可能成為探索PD和氧化應激的新的突破口，有可能成為潛在治療靶點和生物標志物。本研究發現BVRB和PD有關聯性，然而，為了確證BVRB在PD及氧化應激中的作用，需要進一步開展詳盡的機制研究。

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