舒尼替尼對EGFR TKI抵抗的A549細胞株增殖抑制作用及機制研究

潘 峰，田 靜，張旭超，潘躍銀

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，安徽合肥 230022;2.安徽醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，安徽 合肥 230032;3.廣東省肺癌研究所，廣東廣州 510080)

肺癌是腫瘤患者死亡的主要原因，每年大約118萬人死于肺癌［1］，其中非小細胞肺癌大約占總數的80%［2］，大多數患者(80%)在就診時已屬中晚期，5年生存率僅約15%。目前藥物治療是晚期非小細胞肺癌治療的重要手段之一，但總的治療效果并不令人滿意［3］。

肺癌的靶向治療是當前研究的熱點，EGFR TKI如吉非替尼和厄洛替尼已經被批準用于肺癌的二線治療。對EGFR激活突變患者能夠從治療中明顯獲益［4-5］，然而非小細胞肺癌中EGFR突變的發生率僅為10% ～30%［6］，同時 K-ras突變和 EGFR突變相互排斥，含有K-ras突變和EGFR野生型患者對EGFR TKI表現耐藥，幾乎不能從治療中獲益。Schneider等［7］研究發現 K-ras突變和生存減少有關。因此探討如何改善EGFR TKI耐藥患者的生存，尋找新的治療藥物及方案是非常必要的。

舒尼替尼(sunitinib)是一種小分子多靶點的酪氨酸酶抑制劑，當前被FDA批準作為腎癌和對伊馬替尼抵抗的胃腸道間質瘤的治療［8］。已有研究［9-11］發現sunitinib在神經內分泌腫瘤、乳腺癌等其他實體腫瘤中顯示出明顯的抗腫瘤效應。本研究旨在初步探討sunitinib在EGFR TKI耐藥的非小細胞肺癌A549細胞株的增殖抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料人非小細胞肺癌細胞A549細胞株由廣東省醫學科學院(廣東省肺癌研究所)提供。Sunitinib購自Pfizer公司，胎牛血清和RPIM1640購自HyClone公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，噻唑藍(MTT)購自Sigma公司，Annexin V-EGFP購自 Millipore，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自羅氏公司，Bcl-2、β-actin抗體購自CST(Cell Signal Technology)公司，酶標儀購自 BioTek Instruments(BioTek Instruments公司，美國)，流式細胞儀購自BeckMan(BeckMan Coulter公司，美國)

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養A549細胞培養于含10%胎牛血清的RPIM 1640培養液(內含青霉素100 U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1)、5%CO2孵箱、37℃恒溫培養。用0.25%胰酶消化傳代，每1～2天傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞形態的觀察取對數生長期細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，每孔100 μl，細胞密度為3.5 ×107個·L-1，種于 96 孔板中，恒溫培養箱中培養24 h后加藥分組，分別作用24、48、72 h后顯微鏡下觀察藥物作用后細胞形態等變化。

1.2.3MTT法檢測sunitinib對A549細胞的增殖抑制作用取對數生長期細胞，以3.5×107個·L-1種于96孔板中，每孔100 μl。次日貼壁后，分為細胞對照組(僅含細胞和培養基而不含藥物的孔)、空白對照組(僅含培養基而不含細胞的孔)，和6個以2倍濃度稀釋的藥物組，每組6個復孔，實驗中止前4 h 每孔加20 μl的5 g·L-1MTT，培養4 h 后，每孔加入150 μl DMSO，輕輕搖晃10 min，以空白對照調零，在570 nm波長用自動酶標儀測定每孔的吸光度(A)值。①細胞抑制率=1-(加藥組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)×100%。②CompuSyn軟件計算單藥處理組在24、48、72 h的半數抑制濃度(IC50)。實驗重復3次。

1.2.4Annexin V-EGFP熒光染色觀察細胞凋亡取對數生長期細胞，以1×108個·L-1濃度接種于6孔板，次日細胞貼壁后加入 3.5 μmol·L-1和 7.0 μmol·L-1的sunitinib濃度作用24 h誘導細胞發生凋亡，并設立對照，作用時間結束時用PBS洗滌細胞兩次，加入混勻好的試劑〔Binding Buffer、Annexin V-EGFP、碘化丙啶(PI);比例為100 ∶1 ∶1〕，均勻覆蓋6孔板底面，避光、室溫反應5 min。于熒光顯微鏡下觀察，拍照，Annexin V-EGFP熒光信號為綠色，PI熒光信號為紅色。

1.2.5流式細胞術檢測sunitinib對A549細胞株細胞周期的影響取對數生長期的細胞，以1×108個·L-1濃度接種于6孔板中，次日貼壁后，加入3.5 μmol·L-1的sunitinib，同時設立對照組，培養細胞72 h后，吸除培養基，PBS沖洗3次，胰酶消化，懸浮液轉移至離心管，離心后，去上清，加入DAPI染液，避光反應10 min后，流式細胞儀上機檢測，用WM-cycle軟件分析細胞周期分布。實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測Bcl-2蛋白的表達水平取對數生長期的細胞，經胰酶消化后以3×108個·L-1濃度接種入細胞培養瓶內。次日貼壁后，分別加入 1.75、3.5 和 7.0 μmol·L-1濃度的 sunitinib 作用72 h后，提取各處理組及對照組蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品(50 μg/孔)加入10%濃度的SDS-聚丙烯凝膠，經電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗(1∶1 000)孵育過夜，常溫下二抗孵育1 h，然后轉入暗室加ECL發光液，膠片曝光。

1.3統計學分析采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，實驗數據用±s表示，代表至少3次實驗，兩組均數間比較采用t檢驗，各組的組間均數比較用方差分析。

2 結果

2.1sunitinib對A549細胞體外增殖的影響sunitinib作用A549細胞24、48、72 h后，顯微鏡下觀察發現死亡細胞和碎片增多、細胞密度下降、細胞固縮融合。不同濃度不同時間sunitinib對A549細胞增殖抑制率的影響如(Fig 1)所示，sunitinib能夠明顯抑制細胞的生長，并且隨著時間的延長和劑量增加，抑制作用逐漸增強，具有時間和劑量依賴性，且72 h的抑制率＞90%。sunitinib對A549細胞在24 h、48 h、72 h 的 IC50分別為(7.34 ± 0.76)、(5.54± 0.62)、(3.68 ± 0.53)μmol·L-1。

Fig 1 Antiproliferative effects of sunitinib 24 h，48 h，72 h on A549 cells by MTT(±s)

Fig 2 The changes of apoptosis on A549 exposed to sunitinib by fluorescence microscope

2.2熒光顯微鏡觀察sunitinib誘導A549細胞株凋亡sunitinib作用A549細胞24 h后，同對照組相比，處理組凋亡細胞明顯增多，細胞出現核固縮、體積縮小，細胞核或細胞質內可見致密濃染的紅色熒光。且隨著藥物濃度的增加，處于凋亡晚期細胞明顯增多，結果見Fig 2。

2.3sunitinib單藥對A549細胞周期的影響sunitinib作用于A549細胞72 h后，正常狀態下的A549細胞大多數處于G1和S期，G2/M期最少。經sunitinib處理后，G0/G1期比例增加(P=0.012)，S期細胞的比例減少(P=0.01)。結果如Fig 3A，3B所示。

Fig 3A Cell cycle analysis on A549 cells treated with sunitinib for 72 h by flow cytometry(±s)

Fig 3B The proportion of cell cycle on A549 cells treated with sunitinib for 72 h by flow cytometry

2.4不同濃度sunitinib對A549細胞Bcl-2蛋白表達的影響使用不同濃度sunitinib作用A549細胞后，如Fig 4A，B所示，同對照組相比，各個劑量組sunitinib均能夠降低Bcl-2蛋白的表達水平(P＜0.05)，且隨著藥物濃度的增大，Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低(P＜0.05)。

Fig 4A Effects on the expression of Bcl-2 on A549 cells in different concentrations of sunitinib

Fig 4B Relative Bcl-2 levels to control

3 討論

吉非替尼和厄洛替尼是當前被批準用于肺癌治療的靶向藥物，但其在復發的晚期非小細胞肺癌中的有效率僅為10% ～19%［12-13］。EGFR野生型和K-ras突變的非小細胞肺癌并不能從EGFR TKI治療中受益。肺癌發病機制復雜，腫瘤血管生成和多種信號通路的激活在其惡性進展中起著關鍵作用，其中血管生成影響絕大多數腫瘤的生長和轉移。當抑制血管內皮生長因子(VEGF)旁路時，能夠使絕大多數腫瘤臨床癥狀明顯改善［14-15］。因此多靶點治療可能比單靶點治療非小細胞肺癌更有效。

sunitinib是一種小分子多靶點的酪氨酸酶抑制劑，它能夠抑制血管內皮生長因子受體-1/2(VEGFR-1/2)，血小板源性生長因子受體(PDGFR)、集落刺激因子受體-1(CSF-1R)、干細胞生長因子受體(c-KIT)、FMS樣的酪氨酸激酶3(FLT3)和膠質細胞源性神經營養因子受體(RET)［8］。臨床前及臨床研究均顯示出sunitinib具有明顯的抗腫瘤效應。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗發現sunitinib在乳腺癌、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌等腫瘤中的具有抗腫瘤效應［16-18］，臨床前研究也發現sunitinib能夠明顯抑制非小細胞肺癌移植瘤模型［19］。

本實驗通過研究sunitinib作用于耐EGFR TKI非小細胞肺癌A549細胞株，發現其對細胞有增殖抑制作用，且具有時間和劑量的依賴性，同時72 h的抑制率＞90%。提示sunitinib可能成為對EGFR TKI耐藥的非小細胞肺癌的新的靶向治療藥物，體外實驗的藥物濃度可以為今后的體內研究及臨床用藥提供實驗室依據。

同時發現sunitinib處理后的A549細胞出現細胞核固縮、細胞核染色質聚集、碎裂或溶解等細胞凋亡形態學的改變，且隨著藥物濃度的增大，處于晚期凋亡細胞的比例增多。表明sunitinib誘導凋亡可能是其抗增殖作用的機制之一。

通過流式細胞周期分析發現，sunitinib為細胞周期特異性阻滯藥物，能夠誘導細胞阻滯在G0/G1期，這一結果和Hui等［20］研究結果相一致，sunitinib可能通過阻止細胞進入細胞周期的下個時段S期，抑制細胞的生長增殖進而誘發凋亡。Bcl-2家族是當前研究最多的與細胞凋亡相關的原癌基因，它在正常和腫瘤細胞的生長過程中均起著重要作用，其表達產物Bcl-2蛋白是一種能夠抑制細胞凋亡的抗凋亡蛋白，該蛋白表達上調與不良預后有著直接關聯，表達下調能夠增強腫瘤對凋亡的敏感性。在非小細胞肺癌中的研究發現，抑制磷酸化AKT蛋白表達，可以下調 Bcl-2 的表達［21］。Yang 等［22］研究顯示sunitinib可以通過抑制STAT和PI3K/AKT等信號通路而提高凋亡，這些研究結果提示STAT、PI3K/AKT等信號通路可能參與了Bcl-2表達的調控。本實驗通過Western blot分析發現，sunitinib能夠下調Bcl-2的表達水平，且隨著藥物濃度的增加Bcl-2蛋白的表達逐漸降低，提示sunitinib誘導A549凋亡可能是通過抑制PI3K/AKT等信號通路而下調Bcl-2蛋白表達有關。

sunitinib對A549細胞具有抗增殖和誘導凋亡作用，其機制可能與誘導細胞周期阻滯和下調Bcl-2的表達有關。該項研究可以為sunitinib對耐EGFR TKI的非小細胞肺癌的治療提供一定的理論基礎。但是，sunitinib是多靶點的靶向藥物，抗腫瘤機制較為復雜，仍需深入研究探討。

(致謝:感謝吳一龍教授給本實驗提供實驗平臺。)

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