鈣激活中性蛋白酶-2對肝癌細胞阿霉素耐藥性的影響

徐國強，唐佳艷，2，向 敏，3，王 艷，洪 陽，胡曉霞，王旭東，陳騰祥

(貴陽醫學院1.生理學教研室、2.附屬醫院消化內科、3.附屬醫院兒科，貴州 貴陽 550004，4.貴陽市衛生局，貴州 貴陽 550081)

耐藥性是腫瘤復發以及復發后化療失效的重要原因。腫瘤細胞與正常細胞一樣，受到外界刺激后，也可以產生應激性反應，提高其對環境變化的適應性，這是腫瘤細胞對化療產生耐藥性的基本原理［1］。Calpain是一種蛋白質水解酶，其通過有限酶解底物參與許多細胞信號轉導通路的活動，發揮多種生物學功能。研究發現［2］，calpain通過酶解細胞周期蛋白E(cyclin E)促進乳腺癌細胞的增殖，提示其是促進腫瘤惡性的重要蛋白，也可能是腫瘤細胞化療耐藥性的機制之一。研究以鈣激活中性蛋白酶-2(calpain-2)作為對象，觀察其在肝癌細胞中的表達，及其與阿霉素(adriamycin，ADM)耐藥之間的關系。

1 材料與方法

1.1藥物和試劑Calpain 2 Large Subunit(M-type)Antibody、Cyclin E(HE12)Mouse mAb(美國Cell Signaling Technology公司);calpastatin peptide(美國Merck公司)，DMEM、胎牛血清(FBS)(美國Invitrogen公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、聚丙烯酰胺、雙甲叉丙烯酰胺(美國Sigma-Aldrich公司);其它試劑均為進口或國產分析純。

1.2主要儀器及設備電泳儀及微型垂直電泳槽(美國GE公司)，GBOX iChemiXR化學發光及凝膠成像儀(美國Syngene公司)、epoch微孔板閱讀器(美國Biotek公司)，高速冷凍離心機(美國Beckman公司)。

1.3細胞株HepG2細胞株為廣州啟動子生物科技有限公司凍存，復蘇后培養于 DMEM培養液、37℃、體積分數為0.1的FBS和0.05的CO2。

1.4MTT實驗收集對數生長期HepG2細胞，以每孔5 000個細胞的密度鋪于96孔板中，培養12 h后加入倍比稀釋的ADM(每個濃度設5個復孔)。上述條件培養72 h(48 h時換液和補充ADM 1次)。棄培養液，每孔加入 20 μl MTT 溶液(12.1 μmol·L－1)孵育4 h后，加入150 μl二甲基亞砜，微孔板閱讀器測各孔的吸光值(OD 490 nm)，計算半數致死量。

按上述方法將HepG2細胞鋪至96孔板中，給予ADM(LD50)或calpain-2抑制劑calpastatin peptide(20 nmol·L－1)孵育細胞72 h，如上所述用MTT法檢測細胞的成活率。未予ADM和calpastatin peptide處理的HepG2的MTT值作為分母，計算其它組細胞的相對存活率。

1.5Western blotHepG2鋪6 cm培養皿，擴大培養至80%的細胞滿度，給予ADM(LD50)或20 nmol·L－1calpastatin peptide孵育72 h。洗滌后加入預冷RIPA細胞裂解液［3］，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4℃ 12 000 r·min－1離心 30 min，取上清液作為蛋白樣品進行Bradford法定量，上樣行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，室溫封閉1 h，4℃ I抗孵育過夜，室溫Ⅱ抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化學發光試劑，GBOX iChemiXR進行化學發光檢測。Gene-Tools軟件進行條帶分析，用calpain-2或cyclin E條帶的灰度值除以內參 β-actin的灰度值，再乘以100%算得calpain-2或cyclin E的相對表達水平。

1.6統計學方法利用SPSS16.0的回歸概率模型計算ADM對細胞的半數致死量，對細胞存活率和蛋白質相對表達水平進行方差分析。

2 結果

2.1ADM對細胞的抑制作用及半數致死量ADM對 HepG2細胞具有明顯的抑制作用，隨著ADM濃度的增大，存活的HepG2細胞數量明顯減少，統計計算ADM對HepG2的半數致死量為2.5 μmol·L－1。

2.2ADM對HepG2細胞calpain-2表達及酶解的影響以ADM(2.5 μmol·L－1)處理96孔板中的HepG2細胞不同的時間，結果提示，ADM能夠誘導calpain-2表達，但是在短時間(4 h以內)calpain-2的表達沒有明顯增加，反而略有下降(P＜0.05)，12 h后calpain-2的表達量開始上升(P＜0.05)，48 h后尤其明顯(P＜0.01)。伴隨著calpain-2的表達量增加，其剪切片段數目也明顯增多，而且被剪切的量也增多(P＜0.05)。見Fig 1。

2.3calpain-2活性抑制對ADM作用下的HepG2的存活率的影響及Cyclin E的表達沒有ADM作用時，calpain抑制劑calpastatin peptide在72 h內對HepG2 生長沒有影響;但是給予 2.5 μmol·L－1ADM處理72 h后，HepG2的存活率下降了(P＜0.05)，而且calpastatin peptide明顯使ADM處理的HepG2細胞的存活率更低(P＜0.01)，見Fig 2。

2.4calpain-2活性抑制對ADM作用下的HepG2中的Cyclin E表達及酶解的影響Cyclin E在HepG2中有表達。沒有 ADM作用時，calpastatin peptide對cyclin E的表達沒有明顯的影響，但可以抑制cyclin E的酶解。給予2.5 μmol·L－1ADM 72 h后，cyclin E的酶解成為LMW形式更加明顯(P＜0.01)，calpastatin peptide可以明顯減少ADM引起的cyclin E的酶解(P＜0.01)。見Fig 3。

Fig 1 The expression and zymohydrolysis of calpain-2 in HepG2 treated with ADM

Fig 2 The effect of calpain-2 inhibitor on the survival rate of HepG2 treated with ADM

Fig 3 The effect of calpain-2 inhibitor on the expression and zymohydrolysis of cyclin E in HepG2 treated with ADM

3 討論

ADM可干擾轉錄過程，誘導腫瘤細胞凋亡［4］。然而，癌細胞受到ADM刺激后，會引起應激性的保護:一方面，通過 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)耐藥基因表達上調，減少化療藥物入胞［5］，另一方面，通過細胞周期調節機制減少細胞凋亡［6］。如結果所示，ADM刺激的早期可檢測到calpain-2的表達降低，提示在ADM早期應激事件中，calpain-2可能被大量利用并降解減少，而作用一定時間后(大于12 h)，calpain-2的表達增高、酶解程度增強，表明ADM并非直接誘導calpain-2的表達上調和活性增加，而是通過誘導其它基因表達改變后，間接上調calpain-2及其活性，這與Su等［7］報道的應激誘導calpain-2上調和活性有一致性。外源性給予calpain-2抑制劑后，ADM誘導肝癌細胞凋亡的程度增強，表明calpain-2表達和活性增加可使肝癌細胞耐受ADM誘導的凋亡。提示calpain-2可以作為降低腫瘤化療耐藥性的潛在靶點，應予深入研究。

研究發現［8－9］，Calpain-2 可通過酶解 cyclin E參與細胞周期調控，并增加癌細胞的惡性程度［2］。結果提示，ADM可使肝癌細胞中cyclin E被酶解程度增加，而calpain-2抑制劑可逆轉ADM引起的cyclin E的酶解，因此表明抑制劑可通過抑制calpain-2活性而減少ADM誘導的cyclin E的酶解。而cyclin E酶解減少可能與肝癌細胞凋亡增加有關，這與Ugland H等的報道一致［10］。至于cyclin E的穩定性增加如何導致癌細胞凋亡增加，還有待進一步研究。

［1］Hanahan D，Weinberg R A.Hallmarks of cancer:the next generation［J］.Cell，2011，144(5):646 － 74.

［2］Wang X D，Rosales J L，Magliocco A，et al.Cyclin E in breast tumors is cleaved into its low molecular weight forms by calpain［J］.Oncogene，2003，22(5):769 －74.

［3］Conacci-Sorrell M，Ngouenet C，Eisenman R N.Myc-nick:a cytoplasmic cleavage product of Myc that promotes alpha-tubulin acetylation and cell differentiation［J］.Cell，2010，142(3):480－93.

［4］Yoshida M，Suzuki T，Komiya T，et al.Induction of MRP5 and SMRP mRNA by adriamycin exposure and its overexpression in human lung cancer cells resistant to adriamycin［J］.Int J Cancer，2001，94(3):432－7.

［5］王玲，劉世坤，周于祿，等.華蟾素對人乳腺癌細胞阿霉素多藥耐藥性的逆轉作用［J］.中國藥理學通報，2007，23(5):677－80.

［5］Wang L，Liu S K，ZhouY L，et al.Reversal effect of cinobufacine on adriamycin resistance of human breast cancer cells［J］.Chin Phamarcol Bull，2007，23(5):677 －80.

［6］Livingston D M，Silver D P.Cancer:crossing over to drug resistance［J］.Nature，2008，451(7182):1066 －7.

［7］Su L T，Chen H C，Gonzalez-Pagan O，et al.TRPM7 activates mcalpain by stress-dependent stimulation of p38 MAPK and c-Jun N-terminal kinase［J］.J Mol Biol，2010，396(4):858 －69.

［8］Libertini S J，Robinson B S，Dhillon N K，et al.Cyclin E both regulates and is regulated by calpain 2，a protease associated with metastatic breast cancer phenotype［J］.Cancer Res，2005，65(23):10700－8.

［9］Wierstra I，Alves J.Cyclin E/Cdk2，P/CAF，and E1A regulate the transactivation of the c-myc promoter by FOXM1［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，368(1):107－15.

［10］Ugland H，Boquest A C，Naderi S，et al.cAMP-mediated induction of cyclin E sensitizes growth-arrested adipose stem cells to DNA damage-induced apoptosis［J］.Mol Biol Cell，2008，19(12):5082－92