全反式維甲酸對骨肉瘤細胞143B生長的影響

牟鈺欽，周龍洋，楊秋珺，周岐新，何百成

(重慶醫(yī)科大學藥理教研室，重慶 400016)

骨肉瘤是兒童和成人中常見的一種非血液系統(tǒng)性惡性腫瘤，多由分化程度較低的成骨細胞所致，且具有很高的肺轉移特性［1］。越來越多的證據(jù)表明，成骨分化缺陷可導致骨肉瘤的發(fā)生［2］，成骨祖細胞成骨分化早期出現(xiàn)調控異常，可致惡性程度很高的骨肉瘤，反之骨肉瘤的惡性程度會有所降低。骨肉瘤的臨床治療面臨多種挑戰(zhàn)，如:常規(guī)化療的副作用、腫瘤細胞的耐藥性及骨肉瘤細胞肺轉移［2］。為克服或防止這些情況的發(fā)生，采用分化治療或分化治療合并傳統(tǒng)的化療來治療這類疾病的方法越來越受到人們的重視。研究表明一些核受體激動劑能明顯促進腫瘤細胞分化而抑制腫瘤生長，其中全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)已成功用于治療急性早幼粒細胞白血病［3］。文獻報道，ATRA能抑制骨肉瘤細胞生長，但其作用機制還不是很清楚;本研究對ATRA抑制骨肉瘤細胞生長的機制作進一步探討。結果顯示，ATRA抑制骨肉瘤細胞增殖作用至少與促進骨肉瘤細胞成骨分化有關。

1 材料及方法

1.1試劑及細胞培養(yǎng)人骨肉瘤細胞143B和MG63購自 ATCC(American Type Culture Collection)。全反式維甲酸購自BIOMOL，用DMSO溶解。實驗所用抗體均購自 Santa Cruz。細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%的青、鏈霉素，培養(yǎng)條件為5%的CO2及37℃。

1.2RT-PCR及Western blot檢測將細胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，提取總RNA前24 h將完全培養(yǎng)基換為含1%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。利用TRIzol法提取總RNA。通過RT-PCR制備cDNA，進行PCR檢測維甲酸受體在骨肉瘤細胞143B和MG63中的內源性表達。

實驗所用PCR引物如下，RARα引物:上游5'-CAGCGACTCCTTGGACAGA-3'，下 游 5'-GGCAGAGG GGTGTCTTGAT-3';RARβ引物:上游 5'-GGTTTC ACTGGCTTGACCAT-3'，下游 5'-AAGGCCGTCTGAG AAAGTCA-3';RARγ引物:上游5'-AACAAGGTGAC CAGGAATCG-3'，下 游 5'-TGTCAGGTGACCCTTCTTC C-3';RXRα引物:上游5'-GCTTCCTTCACCAAGCA CA-3'，下游5'-CGCTTGTCAATCAGGCAGT-3';RXRβ引物:上游5'-CAGGGCAGAACCAAGAACAT-3'，下游5'-GAAATCACCCCAAATCATGG-3';RXRγ引物:上游5'-TGTGGTCAACAGTGTCAGCA-3'，下游5'-GTC TCCACAGATGGCACAGA-3'。

另將指數(shù)生長的細胞鋪于6孔板中，待細胞貼壁后進行相應的處理。于不同檢測時間點，提取各組總蛋白并用BCA法測定總蛋白濃度。按常規(guī)Western blot方法進行，最后用ECL化學發(fā)光顯色，并用凝膠成像儀成像。每組實驗重復3次。

1.3細胞增殖實驗將指數(shù)生長的細胞鋪于24孔板，用不同濃度的ATRA處理細胞。分別在24、48和72 h將細胞用胰酶消化進行計數(shù)(用臺盼藍染色區(qū)別壞死細胞)。每組實驗重復3次，結果取平均值。

1.4凋亡檢測實驗將指數(shù)生長的細胞鋪于6孔板，用 20 μmol·L－1的 ATRA 處理 143B 細胞，分別于第12和24 h提取總蛋白，然后按前述方法進行Western blot檢測Caspase-3的蛋白水平變化情況。另用 20 μmol·L－1ATRA 處理 143B 細胞，24 h 后進行凋亡染色，按試劑盒說明書進行操作(Vybrant Apoptosis Assay kit，V-23201)，每組實驗重復3次。

1.5螢光素酶報告質粒實驗將指數(shù)生長狀態(tài)的細胞鋪于24孔板中，待細胞貼壁后，每孔利用lipofectamine(購自 Invitrogen)轉染0.25 μg報告質粒，6 h后終止轉染并換用正常培養(yǎng)基。加入不同濃度的ATRA，24 h后裂解細胞，按照試劑盒說明進行螢光素酶活性測定。BCA法測定裂解液總蛋白濃度，用于對螢光素酶活性進行校正。每組實驗重復3次，結果取平均值。

1.6骨橋素、骨鈣素蛋白表達檢測實驗將指數(shù)生長的細胞鋪于6孔板，待細胞貼壁后用相應濃度的ATRA處理，分別于D9和D11提取總蛋白，通過Western blot檢測骨橋素(osteopontin，OPN)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)蛋白表達水平。

1.7統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)以±s表示，t-test進行組間比較。

2 實驗結果

2.1維甲酸受體與視黃醇X受體在143B骨肉瘤細胞中的內源性表達143B和MG63骨肉瘤細胞中維甲酸受體(RAR)及視黃醇X受體(RXR)的內源性表達如Fig 1所示。RT-PCR結果顯示:RAR及RXR各型受體的mRNA在143B和MG63骨肉瘤細胞中均有表達，并且 Western blot也能夠檢測到RARα和RXRα的蛋白表達。提示，143B和MG63骨肉瘤細胞中存在維甲酸信號通路。

2.2ATRA呈現(xiàn)濃度依賴性抑制143B骨肉瘤細胞增殖ATRA對143B細胞的增殖抑制如Fig 2所示。結果顯示，ATRA能明顯抑制143B細胞增殖，并且這種抑制作用呈濃度依賴性增強。

2.3ATRA誘導143B骨肉瘤細胞凋亡ATRA誘導143B細胞凋亡結果如Fig 3所示。Western blot檢測Caspase-3蛋白水平結果顯示，ATRA處理143B細胞12 h后，處理組Caspase-3蛋白水平明顯高于對照組，而24 h無變化。凋亡染色結果顯示，ATRA處理后，凋亡及死亡細胞陽性染色明顯增多。提示，ATRA能夠誘導143B骨肉瘤細胞凋亡。

Fig 1 Endogenous nuclear receptor expression in osteosarcoma

Fig 2 Inhibitory effect of ATRA on 143B osteosarcoma cells(±s，n=3)

Fig 3 Effect of ATRA on apoptosis of 143B osteosarcoma cells

2.4ATRA誘導143B骨肉瘤細胞骨向分化ATRA誘導143B細胞成骨分化檢測結果如Fig 4、5所示。結果顯示，ATRA處理后，Runx2報告質粒螢光素酶活性明顯升高，表明Runx2轉錄活性增強(Fig 4);Western blot結果示，OPN及OCN表達增加(Fig 5)。提示，ATRA能夠促進143B骨肉瘤細胞骨向分化。

Fig 4 ATRA promote Runx2 induced transcription activity in 143B osteosarcoma cells(±s，n=3)

Fig 5 ATRA induced OPN and OCN expression in 143B osteosarcoma cells(n=3)

3 討論

骨肉瘤是一種惡性腫瘤，其特征是成骨祖細胞處于不同的分化狀態(tài)［4］。目前臨床對于骨肉瘤的治療面臨兩個主要的問題:其一是常規(guī)化療給患者帶來的嚴重不良反應和毒副作用。第二個問題是難于對骨肉瘤肺轉移作早期診斷。因此，臨床上急需一種低毒高效的方法治療骨肉瘤這類疾病。

誘導腫瘤細胞終末分化可以使一些惡性腫瘤得到治療，比如:用全反式維甲酸治療急性早幼粒細胞白 血 病 (acute promyelocytic leukemia，APL)［3］，PPARγ激動劑能抑制人乳腺癌、結腸癌和脂肪肉瘤等腫瘤細胞的生長［5］。目前對腫瘤的化療主要是用細胞毒性藥物殺死增殖迅速的腫瘤細胞，這類藥物多具有嚴重的不良反應。與傳統(tǒng)化療藥物相反，促進腫瘤細胞分化的藥物不僅具有較少的不良反應，而且能明顯降低腫瘤的惡性程度。

成骨祖細胞因為一些遺傳因素或突變使成骨分化過程受到干擾，最終導致骨肉瘤發(fā)生。這種分化缺陷的觀點可從以下事實得到證實:骨肉瘤細胞具有末分化成骨細胞的特點［1，2，6］，成骨分化轉錄調節(jié)因子Runx2并不能有效促進骨肉瘤細胞成骨分化;成骨性骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)不能誘導人骨肉瘤細胞成骨分化，而是表現(xiàn)出促進骨肉瘤生長［7］;我們的實驗也顯示:多種骨肉瘤細胞株和原代骨肉瘤細胞其堿性磷酸酶表達程度存在明顯差別(資料未附)。

ATRA能與核受體RAR(Retinoic Acid Receptor)和RXR(Retinoids X Receptor)受體結合形成雜合二聚體，最終與DNA靶基因的調節(jié)位點結合，調節(jié)下游目的基因表達［8］。ATRA已被用于臨床治療APL，并取得了巨大的成功，其機制就是ATRA促進急性早幼粒細胞白血病細胞進行正常分化。文獻報道［9］，ATRA能夠抑制骨肉瘤細胞的生長，其機制可能涉及CyclinD2和CDK4表達的下調從而導致低磷酸化pRb積累;ATRA不但能夠抑制MG-63細胞生長，也能抑制 MG-63細胞的侵襲轉移能力［10］;ATRA還可以促進人骨肉瘤細胞一定程度良性分化［11］。ATRA能夠明顯增強BMP9(bone morphogenetic protein 9)誘導的間充質干細胞成骨分化［12］，BMP9是目前已知BMPs成員中誘導間充質干細胞成骨分化能力最強的因子。以上研究表明，ATRA對可能是通過促進分化抑制骨肉瘤生長，但其具體機制還不清楚。

我們的研究表明，ATRA能夠使143B骨肉瘤細胞生長受到抑制并促進凋亡，這種作用與ATRA促進骨肉瘤細胞分化有關。ATRA能促進成骨分化不同時期的成骨標志物在143B骨肉瘤細胞中表達:早期可以促進成骨分化轉錄調節(jié)因子Runx2表達，中晚期可促使OPN及OCN表達，且晚期可促進鈣鹽沉積(資料未附)。提示:ATRA能在不同分化階段促進骨肉瘤細胞骨向分化，從而抑制骨肉瘤細胞生長。雖然ATRA單獨使用或許并不能有效的治療骨肉瘤，但可以作用一種輔助治療方式，與常規(guī)治療方式聯(lián)合運用，提高對骨肉瘤的治療效果，同時降低常規(guī)治療方式帶來的嚴重不良反應。

［1］Sandberg A A，Bridge J A.Updates on the cytogenetics and molecular genetics of bone and soft tissue tumors:osteosarcoma and related tumors［J］.Cancer Genet Cytogenet，2003，145:1 －30.

［2］Tang N，Song W X，Luo J，et al.Osteosarcoma development and stem cell differentiation［J］.Clin Orthop Relat Res，2008，466:2114－30

［3］Kambhampati S，Verma A，Li Y，et al.Signalling pathways activated by all-trans-retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells［J］.Leukemia Lymphoma，2004，45(11):2175 －85.

［4］Dorfman H D，Weiss S W.Borderline osteoblastic tumors:problems in the differential diagnosis of aggressive osteoblastoma and low-grade osteosarcoma［J］.Semin Diagn Pathol，1984，1:215 －34.

［5］Park B H，Breyer B，He T C.Peroxisome proliferator-activated receptors:roles in tumorigenesis and chemoprevention in human cancer［J］.Curr Opin Oncol，2001，13:78 － 83.

［6］Thomas D M，Johnson S A，Sims N A，et al.Terminal osteoblast differentiation，mediated by runx2 and p27KIP1，is disrupted in osteosarcoma［J］.J Cell Biol，2004，167:925 －34.

［7］Luo X，Chen J，Song W X，et al.Osteogenic BMPs promote tumor growth of human osteosarcomas that harbor differentiation defects［J］.Lab Invest，2008，88:1264 －77.

［8］Germain P，Chambon P，Eichele G，et al.International Union of Pharmacology LX Retinoic acid receptors［J］.Pharmacol Rev，2006，58(4):712 －25.

［9］李 揚，丘鉅世，鄧家德，等.全反式維甲酸對骨肉瘤細胞OS732生長的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2005，15(15):2271－2.

［9?.Li Y，Qiu J S，Deng J D，et al.Effect of retinoic acid on growth of osteosarcoma cell line OS732［J］.Chin J Mod Med，2005，15(15):2271－2.

［10］張 巖，姜 侃，夏仁云.全反式維甲酸體外誘導分化對人骨肉瘤MG-63細胞侵襲轉移的影響［J］.華中科技大學學報，2006，35(5):616.

［10］Zhang Y，Jiang K，Xia R Y.Effect of ATRA on Invasion and Metastasis of human osteosarcoma MG-63 cell during differentiation inductionin vitro［J］.J Huazhong Univ Sci Technol，2006，35(5):616.

［11］張 強，范清宇，張殿忠，等.全反式維甲酸對人骨肉瘤細胞抑制增殖和誘導分化的實驗［J］.中國臨床康復，2005，9(22):150－2.

［11］Zhang Q，F(xiàn)an Q Y，Zhang D Z，et al.All-trans retinoic acid in inhibiting the proliferation and inducing the differentiation of human osteogenia sarcome cells［J］.Chin J Chin Rehab，2005，9(22):150－2.

［12］Zhang W，Deng Z L，Chen L，et al.Retinoic acids potentiate BMP9-induced osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells［J］.PLos One，2010，5(7):e11917.