山茱萸最佳配伍組分對高糖致ECV304細胞氧化損傷的保護作用

許惠琴，農偉虎，劉成鼎，李 莉，劉 洪，劉 斌，吳佳蕾

(1.南京中醫藥大學藥學院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210046)

目前認為，糖代謝紊亂、活性氧失衡、血管活性物質、遺傳因素及生長因子在糖尿病血管病變的發生發展中都起著重要作用，其中活性氧的作用日益受到重視［1］。已往的實驗觀察到血管內皮細胞在高糖環境中損傷明顯，細胞形態及細胞周期均發生明顯的改變［2－3］。為此，本實驗通過觀察 ECV304細胞在高濃度葡萄糖作用下超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及活性氧(ROS)的變化，研究山茱萸最佳配伍組分保護血管內皮細胞的作用機制。

1 材料

1.1藥物及試劑山茱萸藥材購于河南西峽，經我校中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.etZucc.的干燥成熟果肉。

山茱萸有效部位的制備:環烯醚萜苷:藥材500 g加12倍量的水提取2次，每次2 h，濾液70%乙醇醇沉，靜置24 h以上，過濾。將上清液加水定容至0.5 g生藥/ml，上大孔樹脂用12倍量10%乙醇3.5 BV/h洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥至恒重，得到山茱萸環烯醚萜總苷24.9588 g(純度馬錢苷25.01%;莫諾苷15.16%;二苷總和40.17%);三萜酸:將水提后藥渣瀝干，按1∶6(溶劑:未水提之前的藥材質量)95%乙醇在85℃，提取2次，旋轉蒸發除去溶劑，真空干燥得干浸膏。將干浸膏用10%NaOH洗滌，再用等倍量的酸性水溶液沉淀得三萜酸浸膏1.1692g(純度58%);多糖:將水提醇沉的藥渣在0.15 Mpa，35℃超濾，于60℃真空干燥至恒重，得到山茱萸總多糖提取物36.8694 g(純度55.93%)，然后用分子篩篩選得到1 000～60 000 ku的多糖(經實驗證明為最具活性的多糖部分)。

經前期正交設計實驗發現山茱萸防治糖尿病血管病變的最佳有效部位配比是環烯醚萜苷(A)∶三萜酸(B)∶多糖(C)為2∶1∶2(該比例折合山茱萸中所含份量表示，以下用A2B1C2表示)。

注射用鹽酸川芎嗪(川青)，哈爾濱三聯藥業有限公司，批號:090812。RPMI 1640培養基，Gibco，USA，lot NO:461418。碳酸氫鈉，上海試劑四廠，批號:20000910。小牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號:080405。胰蛋白酶(Trypsin)，MERCK，USA，批號:0428S05。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20070919。磷酸鹽緩沖溶液，中杉金橋。葡萄糖，中國醫藥(集團)上海化學試劑有限公司，批號:F20070919。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，批號:20100119;丙二醛(MDA)試劑盒，批號:20100119;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，批號20100119，南京建成生物工程研究所提供。

2'，7'-二氯氫化熒光素二脂(2'，7'-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA)，碧云天生物技術研究所，批號:S0033。

1.2動物及細胞株清潔級SD大鼠，220～240 g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證:SCXK(蘇)2002-0027。ECV304，引自南京中醫藥大學基礎醫學院，由本實驗室復蘇、傳代保存。

1.3儀器DKB-8A型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司。NAPCO5410型 CO2培養箱，PERCISION SCIENTIFIC。XSZ-D2型倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠。LDZ5-2醫用離心機，北京醫用離心機廠。TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司。TU-1800S型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

2 方法

2.1含藥血清的制備取SD大鼠，給藥劑量為116 mg·kg－1，每天灌胃給藥1次，每次給藥容積為10 ml·kg－1;另設空白對照組每天灌服等體積蒸餾水。連續給藥5 d后禁食8 h，于d 6末次給藥1 h后頸動脈取血，4℃靜置 4 h，3 000 r·min－1離心 20 min，分離血清，于56℃水浴中滅活補體30 min，經0.22 μm微孔濾器除菌，－20℃保存備用。以此作為山茱萸有效部位最佳配伍組分高劑量組，稀釋一半作為其最佳配伍組分低劑量組。

2.2細胞培養及給藥將ECV304細胞接種至24孔(每孔1 ml)培養板內，加入10%FBS RPMI 1640培養液，在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。待細胞融合80% ～90%，換液加入RPMI 1640培養液，24 h后吸去上清，加含30 mmol·L－1高糖的RPMI 1640培養液。然后各組分別加入A2B1C2含藥血清低、高劑量和川芎嗪，培養48 h。

2.3細胞培養上清液中SOD、MDA和GSH-Px的測定培養48 h后取細胞上清液，按試劑盒說明書測定SOD、MDA和GSH-Px。

2.4細胞內ROS的測定吸棄培養上清后，將10 μmol·L－1DCFH-DA 400 μl加到細胞板中，37℃繼續培養20 min。吸棄上清，加無血清RPMI 1640培養液400 μl，用激光共聚焦顯微技術(激發波長488 nm，發射波長525 nm)分別檢測各組的熒光強度。

2.5統計學方法計量資料以±s表示，數據用SPSS11.5軟件包進行處理，組間比較方差齊性的采用LSD，方差不齊者采用秩和檢驗。

3 結果

3.1對SOD、MDA和GSH-Px的影響采用黃嘌呤氧化酶法于550 nm處測定SOD的活力。實驗結果顯示，30 mmol·L－1高糖環境下SOD酶活性降低(P＜0.01)，而A2B1C2含藥血清兩個劑量組均能提高此活力，與高糖組比較差異具有顯著性(P＜0.01)。

根據過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰的原理，采用TBA法于532nm處測定MDA的含量。實驗結果顯示，高糖環境下，細胞上清液中MDA含量增加(P＜0.01)，而A2B1C2高、低劑量組含藥血清能降低其含量，與高糖組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。

根據GSH-Px可促進過氧化氫與GSH反應生成GSSG的原理，通過測定酶促反應中GSH的消耗速度來反映GSH-Px的活力。實驗結果顯示，30 mmol·L－1高糖環境下，GSH-Px活性降低(P＜0.01)，而A2B1C2高、低劑量組含藥血清能提高此活力，與高糖組比較差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Effect of the best compatibility of components in Fruetus Corni on the activity of SOD，MDA and GSH-Px in ECV304 cultured in high glucose medium(n=8)

3.2對ROS的影響根據DCFH-DA進入細胞后的水解產物DCFH可以被細胞內活性氧氧化為有熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強度來反映細胞內ROS的水平。實驗結果顯示，30 mmol·L－1高糖增加ROS含量，而A2B1C2高、低劑量組含藥血清能減少ROS水平，與高糖組比較差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)，結果見 Tab 2，Fig 1。

4 討論

山茱萸中相關活性成分主要是五環三萜酸、總苷及多糖。既往研究發現［4－5］，山茱萸乙酸乙酯提取部位、乙醇提取液具有降低血糖和升高胰島素水平。山茱萸環烯醚萜苷對糖尿病血管病變大鼠，能保護胸主動脈內皮、減少尿微量白蛋白的排出、下調腎皮質RAGE及TGF-β mRNA的表達，保護血管內皮及抗腎小球內基質增生、基底膜增厚等作用［6－9］。山茱萸多糖具有抗氧化作用［10－11］。據此，實驗室將山茱萸有效部位環烯醚萜苷、多糖和三萜酸加以配伍組合，試圖觀察在抗糖尿病血管病變上是否具有增強作用及何種比例獲得最佳效果。結果在前期實驗中，通過高糖對血管內皮細胞的增殖反應和對四氧嘧啶糖尿病小鼠的腎臟保護作用，篩選得到山茱萸最佳配伍組合為環烯醚萜苷∶三萜酸∶多糖比例是2∶1∶2。因此本實驗試圖從抗氧化水平的角度，分析山茱萸最佳配伍組合保護糖尿病血管病變的作用機制。

Fig 1 Effect of the best compatibility of components in Fruetus Corni on the ROS levels in ECV304 cultured in high glucose medium

Tab 2 Effect of the best compatibility of components in Fruetus Corni on the ROS levels in ECV304 cultured in high glucose medium(n=6)

有研究表明在長期高糖環境下，能誘導細胞發生多重代謝障礙，導致大量ROS堆積，細胞內的氧化應激增加，造成腎臟損傷，同時ROS又可激活炎癥過程刺激信號的傳遞介質如NF-κB途徑而損傷腎臟［12－13］。MDA是脂質過氧化反應的產物之一，常常可反映脂質過氧化的程度［14］，間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。而此時機體內抗氧化物質如SOD、GSH-Px等活性降低，明顯削弱了機體清除自由基的能力。本實驗研究證實，30 mmol·L－1濃度葡萄糖刺激血管內皮細胞后，ROS與MDA水平較正常組有明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)，顯示高糖可通過氧化應激反應損傷血管內皮細胞。在應用山茱萸最佳配伍組合后，對上述指標具有明顯的逆轉作用，且高劑量組優于低劑量組。其保護血管內皮細胞主要通過以下2種途徑:①抑制ROS的生成，減少各種氧自由基對細胞的氧化損傷;②增強SOD、GSH-Px等抗氧化酶系統的活性，對抗氧自由基和脂質過氧化物對細胞的毒害作用，保護細胞膜結構和功能的完整性。總之，本實驗研究表明山茱萸最佳配伍組合是通過抑制高糖所致的氧化應激，達到防治糖尿病血管病變的目的。

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