石菖蒲α-細辛醚對Lithium-Pilocarpine癲癇模型GABA系統的調控作用

苗靜琨，陳啟雄，吳小玫，張曉萍

(重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒科，兒童發育疾病研究省部共建教育部重點實驗室，兒科學重慶市重點實驗室，重慶市兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地，重慶400014)

在前期研究中我們已經證實石菖蒲α-細辛醚對多種實驗性癲癇模型具有確切抗癲癇作用，但其作用機制尚待闡明［1－2］。興奮性神經遞質與抑制性神經遞質作用的失平衡是癲癇發生的基本機制，γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是中樞神經系統(Central nervous system，CNS)內最具有代表性的抑制性神經遞質，介導大約30% ～40%CNS神經元的功能，CNS中GABA含量降低是神經細胞過度興奮，誘發同步放電，產生癲癇發作的重要原因之一［3］。因此，我們采用Lithium-Pilocarpine模型研究了石菖蒲α-細辛醚治療對GABA系統的調控作用，以期從分子水平探討石菖蒲α-細辛醚抗癲癇作用的可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器α-細辛醚，愛生藥業(沈陽)有限公司生產;Lithium、Pilocarpine購自 Sigma公司;GAD67免疫組化試劑盒、GABAAR原位雜交試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，其他試劑均為國產分析醇。氨基酸分析儀為日立L-8800氨基酸自動分析儀，紫外分光光度計為美國Beckman公司DU-7500型。

1.2實驗動物分組及給藥♂Wistar大鼠，體質量200～250 g，購自第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所。隨機分為正常對照組、模型對照組、α-細辛醚治療組(100 mg·kg－1)等3組。各組又分為癲癇持續狀態(Status epilepticus，SE)后 12、24、48、72 h及1周等5個亞組。給予匹羅卡品前60 min，α-細辛醚治療組給予α-細辛醚100 mg·kg－1，正常對照組、模型對照組給予同等劑量的生理鹽水。

1.3建立Lithium-Pilocarpine癲癇模型參照Celine Dube方法加以修改［4］。腹腔注射匹羅卡品后，實驗大鼠出現強直－陣攣持續狀態，即癲癇持續狀態(Status epilepticus，SE)。具體方法:腹腔注射氯化鋰 160 mg·kg－1，18 h ～24 h 后，腹腔注射匹羅卡品 40 mg·kg－1，觀察 120 min，出現 SE 1 h 后腹腔注射安定4 mg·kg－1，以降低死亡率。凡SE持續時間未達標準或中途死亡者均從本實驗中排除。1.4海馬組織GABA含量測定分別于SE后12、24、48、72 h及1周等時相處死實驗大鼠各10只，取雙側腦組織，冰盤上分離海馬，放入組織勻漿器內，按50 mg wwt·ml－1比例加入冰冷的質量分數為10%的磺基水楊酸，充分研磨，制成質量濃度為5 g·L－1的組織勻漿，4℃，20 000 r·min－1冷凍離心10 min，分離上清，采用日立L-8800氨基酸自動分析儀檢測GABA含量。

1.5谷氨酸脫羧酶(GAD67)免疫組織化學檢測分別于SE后各時相，腹腔注射質量分數為1%的戊巴比妥鈉50 mg·kg－1，麻醉后暴露心臟，經左心室插管至升主動脈，快速灌注PBS 250 ml，隨后灌注質量分數為4%的多聚甲醛/0.1 MPBS液500 ml進行內固定，分別取前囟前2.0至4.0 mm處含額葉及前囟后4.0至6.0 mm處含海馬的腦組織，質量分數為25%的蔗糖液中過夜，次日做冠狀冰凍切片，厚度為8～10 μm，室溫放置30 min后，入4℃丙酮固定10 min，PBS洗5 min×3次備檢。以常規SP法進行免疫組化檢測，聯苯二胺(DAB)顯色，蘇木精復染，光鏡下觀察。以PBS取代一抗作為陰性對照。結果判斷:細胞質和(或)細胞核呈棕黃色為GAD67陽性反應。以Tiger920圖像分析系統檢測切片陽性平均光密度(Average optical density，AOD)。每只大鼠取切片3張，在統一放大倍數(×100)及同一光強度下分析額葉、海馬CA1、CA3區陽性平均光密度。

1.6γ-氨基丁酸轉氨酶(GABA-T)活性的檢測分別于SE后各時相處死實驗大鼠各10只，分離雙側海馬及額葉組織，放入組織勻漿器中，加入10倍冰冷的勻漿緩沖液充分勻漿后 8 000 r·min－1，4℃離心15 min，收集上清液，取勻漿上清樣品30 μl，另以勻漿緩沖液30 μl設立對照，加入570 μl pH 8.75的焦磷酸鈉緩沖液，30℃保溫15 min，紫外分光光度計340 nm比色測吸光度。

1.7GABAAR-mRNA原位雜交檢測分別于SE后各時相，腹腔注射質量分數為1%的戊巴比妥鈉50 mg·kg－1，成功麻醉后立即分離腦組織，液氮過夜，次日做冠狀冰凍切片，厚度8～10 μm，入4℃含1/1 000質量分數為4%的多聚甲醛/0.1 MPBS中，室溫固定20 min，0.02 mol·L－1PBS(pH 7.2，Rnase free)漂洗5min×3次，體積分數為0.3的H2O21份+甲醇50份混合，室溫孵育30 min，滴加質量分數為3%的檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，室溫消化10 s，用含有1/1000的質量分數為4%的多聚甲醛/0.1 MPBS室溫固定10 min，每張切片加預雜交液20 μl，恒溫箱內(38～42)℃孵育2 h，每切片加雜交液(探針)20 μl，恒溫箱內(38 ～42)℃孵育過夜，滴加封閉液，37℃孵育30 min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗體，37℃ 孵育 60 min，滴加 SABC，37℃ 孵育 30 min，滴加生物素化過氧化物酶，DAB顯色，蘇木精復染，光鏡下觀察。以PBS取代探針作為陰性對照。結果判斷及圖像分析同前。

1.8統計學分析所有數據均以±s表示，采用SPSS 10.0統計軟件，根據方差齊性與否分別用參數檢驗和非參數檢驗，方差齊性資料單因素多均數比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用t檢驗，非齊性資料采用秩和檢驗。

2 結果

2.1石菖蒲α-細辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型海馬GABA含量的影響模型組大鼠SE后各時相海馬GABA含量均明顯降低，且持續至SE后72 h，之后緩慢增高，至SE后1周接近正常水平，與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。石菖蒲α-細辛醚治療能明顯增加大鼠SE后各時相海馬GABA含量(P＜0.05)，表明石菖蒲α-細辛醚可通過明顯增加海馬GABA含量，從而發揮抗癲癇作用，見 Tab 1。

Tab 1 GABA content in Hippocampus of the Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(nmol·g－1wet tissue，n=10)

2.2石菖蒲α-細辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型GAD67表達的影響模型組大鼠SE后12 h～72 h海馬及額葉GAD67的表達較正常對照組明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)，其中以SE后12 h GAD67的表達下降最為明顯，SE后1周，海馬及額葉GAD67的表達逐漸增加，并接近正常水平。而石菖蒲α-細辛醚治療組大鼠各時相腦內GAD67表達增強，并持續數日以上。在SE后12 h～72 h，石菖蒲α-細辛醚治療組海馬及額葉GAD67表達均明顯高于模型組大鼠 (P＜0.05)。石菖蒲α-細辛醚能增加腦內GAD67表達以增加GABA合成，提高腦內GABA含量，從而發揮抗癲癇作用，見Tab 2。

2.3石菖蒲α-細辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型大鼠γ-氨基丁酸轉氨酶(GABA-T)活性的影響模型組大鼠SE后各時相腦內存在極高的GABA-T活性，與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05);以海馬區的GABA-T活性增高最為突出。石菖蒲α-細辛醚治療使大鼠腦內GABA-T活性在SE后各時相點均有明顯而持續降低(P＜0.05)，有助提高腦內GABA含量，控制癲癇發作;通過腦區間比較，石菖蒲使海馬區GABA-T活性的下調作用明顯強于額葉，差異有顯著性(P＜0.05)，見Tab 3。

2.4石菖蒲α-細辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型GABAAR-mRNA表達的影響模型組大鼠SE后12 h～24 h腦內GABAAR-mRNA表達明顯降低，與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。模型組大鼠腦內GABAAR-mRNA表達高峰主要發生在SE后48 h～72 h;海馬區GABAAR-mRNA表達持續高于額葉 (P＜0.05);石菖蒲α-細辛醚能明顯增強SE后各時相點大鼠海馬與額葉GABAAR-mRNA表達(P＜0.05)，見Tab 4。

3 討論

Lithium-Pilocarpine模型是目前應用最多的癲癇模型之一，該模型SE所導致的海馬神經元丟失、苔蘚纖維絲狀芽生，以及突觸重建正是癲癇自發性發作的組織病理學基礎［6］。實驗大鼠行為學改變與腦電圖異常放電同步，模型建立后能維持較長時間的反復癲癇發作，因而被認為是當前研究癲癇較實用的一種動物模型［7］。

Tab 2 AOD of GAD67 immunoreactivity in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(ODu/mm2，n=10)

GABA是CNS內最具有代表性的抑制性神經遞質，一般認為CNS中GABA含量降低是神經細胞過度興奮，誘發同步放電，產生癲癇發作的重要原因之一［3，5］。GABA 是由腦內谷氨酸經 GAD 脫羧而成，GAD是GABA合成的限速酶，直接影響腦組織中GABA含量，在腦組織中的分布與GABA能神經元基本一致，被視為GABA能神經元的直接標志物［8］。GABA分解代謝首先由 GABA-T將氨基除去、生成琥珀酸半醛(SSA)，后者再經琥珀酸半醛脫氫酶氧化成琥珀酸，參與三羧酸循環，GABA-T是催化GABA生成SSA的關鍵酶，其活性高低直接影響到GABA的水平［9］。GABA通過GABA受體發揮抑制性作用，GABAA受體與癲癇關系最為密切，興奮GABAA受體能抑制癲癇發作，抑制GABAA受體則會誘發癲癇［10］。

Tab 3 GABA-T activity in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(nmol·mg－1Pro·min，n=10)

Tab 4 AOD of GABAA-RNA in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(ODu/mm2，n=10)

在前期研究中我們已經證實石菖蒲α-細辛醚在Lithium-Pilocarpine實驗大鼠模型中具有確切抗癲癇作用［1］。本研究中我們通過觀察Lithium-Pilocarpine模型大鼠GABA含量、GAD67表達、GABA-T活性及GABAA受體表達的動態變化及α-細辛醚治療的影響，探討α-細辛醚抗癲癇作用的可能機制。結果表明，模型大鼠SE后各時相海馬GABA含量均明顯降低，且持續至SE后72 h，之后緩慢增高，至SE后1周始接近正常，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)，證實CNS中GABA介導的抑制性神經功能減弱在癲癇發生中起著重要作用;SE后12 h～72 h海馬GAD67表達較對照組明顯降低(P＜0.05)，其中以SE后12 h GAD67表達下降最為明顯;SE后各時相腦內存在極高的GABA-T活性，表明GABA-T活性增高，可能是Lithium-Pilocarpine模型腦內GABA含量降低的重要原因之一;SE后12 h～24 h腦內GABAAR-mRNA表達降低，差異有顯著性(P＜0.05)。GABAAR-mRNA表達高峰主要發生在SE后48 h～72 h，此與SE后腦內GABA含量逐步回升，抑制性遞質系統功能漸有增強的步伐一致。

石菖蒲α-細辛醚治療能明顯增加Lithium-Pilocarpine模型大鼠SE后各時相海馬GABA含量(P＜0.05);能增強SE后各時相腦內GAD67表達(P＜0.05)，并持續數日以上;能明顯而持續地降低SE后各時相點增高的GABA-T活性，進一步抑制GABA分解代謝，從而上調CNS內GABA含量;能明顯增強SE后各時相點大鼠海馬與額葉GABAAR-mRNA表達(P＜0.05)。

綜上所述，我們認為在Lithium-Pilocarpine誘導的癲癇大鼠中，海馬GABA系統的抑制功能減弱是癲癇產生和發展的關鍵因素。石菖蒲α-細辛醚可能通過抑制GABA-T活性以降低GABA分解代謝，上調GAD67表達使GABA合成增加，上調GABAA受體表達以增強GABA介導的抑制功能從而發揮抗癲癇作用。今后需要進一步研究石菖蒲α-細辛醚對Lithium-Pilocarpine模型慢性期GABA系統的調節，以期能更準確揭示其可能的機制。

(致謝:感謝重慶醫科大學附屬兒童醫院中醫科張茂教授在本研究中給予的技術支持和幫助。)

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