氧化槐定堿鎮痛作用及其對小鼠中樞GABAARα1表達的影響

楊 光，閆 琳，高進賢，易正洪，蔣袁絮

(1.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏銀川 750004;2.甘肅省人民醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

氧化槐定堿(oxysophoridine，OSR)是從苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)中提取的主要生物堿之一［1］。本室前期研究發現OSR在熱板和福爾馬林兩種致痛模型中均具有一定的鎮痛作用，鎮痛作用部位涉及中樞和外周［2］。側腦室注射OSR能明顯增加大鼠皮層、海馬γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)免疫陽性細胞數目，下調GABA轉運體(GABA transporter-1，GAT-1)的基因表達［3-4］。本文在前期研究的基礎上進一步探討OSR(iv)的鎮痛作用以及GABAA受體在OSR鎮痛中的作用。

1 實驗材料

1.1動物昆明種小鼠，♀♂ 兼用，體質量18～22 g，寧夏醫科大學實驗動物中心提供〔合格證號:SCXK(寧)2005-001〕。小鼠分籠飼養，溫度20～22℃，相對濕度50% ～60%，光照明暗各12 h。

1.2藥品及試劑OSR:寧夏紫荊花藥業公司，批號:071217;鹽酸嗎啡注射液(morphine，Mor):沈陽第一制藥廠，批號051106，使用前均用生理鹽水溶解，置4℃冰箱備用。多克隆羊抗GABAARα1抗體購自美國Santa Cruz公司，生產批號:J0509;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG:北京中杉生物技術有限公司，批號:86531;辣根酶標記兔抗山羊IgG(H+L):北京中杉生物技術有限公司，批號:86531。

1.3主要儀器和設備DK-420S型三用恒溫水箱;上海精宏試驗設備有限公司;100LAP/SPLIT MENMORY電子秒表:日本;凝膠成像儀:美國Bio-RAD公司;高速低溫離心機:美國 Bio-RAD公司;SDSPAGE電泳儀:美國Bio-RAD公司;轉移電泳儀:美國Bio-RAD公司;實時定量PCR儀:美國Bio-RAD公司;DYY-Ⅲ電泳儀:北京六一儀器廠。

2 實驗方法

2.1溫浴法痛閾測定依照Luttinger［5］關于溫浴法測定的描述進行操作，于給藥后 10、20、30、45、60、90min測定痛閾變化，并按下式計算痛閾提高率。

2.2給藥方法及分組小鼠50只，♀♂ 兼用，隨機分為5組:空白對照組(NS組);陽性對照組(Mor 40.0 mg·kg-1)和 OSR(500.0，250.0，125.0 mg·kg-1)組，每組10只。除嗎啡采用腹腔注射(intraperitoneal injection，ip)外，其余均為 iv，容量為 0.1 ml/10 g，空白對照組給予等容量NS。分別測定各組給藥前、后小鼠甩尾潛伏期。

2.3熒光實時定量PCR方法檢測GABAARα1基因小鼠42只，♀♂兼用，按取材部位不同分為脊髓組和腦組。脊髓組小鼠21只，隨機分成3組，每組7只:空白對照組(NS)、模型對照組(福爾馬林，Formalin)、OSR組。Formalin組和OSR組分別給予NS(0.1 ml/10 g，iv)和 OSR(500.0 mg·kg-1，iv)35 min 后，小鼠足下注射 2%Formalin 20 μl，30 min取脊髓(腰膨大)。腦組小鼠分組及給藥同脊髓組，3 h 取腦(去小腦);常規 RNA 提取，0.067 mol·L-1瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測RNA質量后用RNA反轉錄試劑盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)將RNA反轉錄成cDNA后用TransStart Green qPCRSuperMix試劑盒進行熒光實時定量PCR反應，以基因相對表達量為指標檢測OSR對Formalin致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA表達的影響，GABAARα1和內參引物 GAPDH均依據 NCBI GenBank中小鼠GABAARα1和GAPHD基因序列號由上海生工生物工程有限公司設計、合成，基因序列如下:GABAARα1:(f):5'CAAGTCTCCTTCTGGCTCAAC3';(r):5'TTTACTGTGGCAAACTCAATC3';產物長度:200 bp;退火溫度:52。GAPDH:(f):5'AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG3';(r):5'AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG3'。產物長度:294 bp;退火溫度:52。

2.4Western blot法檢測GABAARα1蛋白動物分組及給藥同“2.3”，1.5 h 取脊髓、4 h 取腦(去小腦)，RIPA裂解液提取蛋白，經考馬斯亮藍染色測定蛋白質含量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，電轉移至硝酸纖維素膜(300 mA，90 min)，5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，多克隆羊抗GABAARα1抗體(1∶600)，4℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加上辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶3 000)4℃孵育3 h，PBST次洗膜3次后，利用Western blot熒光試劑(Ecl)進行化學曝光，按標準程序顯影、沖洗膠片，采用凝膠圖像分析成像系統對圖片上每個特異條帶進行掃描分析，得出目的條帶面積灰度值。以目的蛋白的灰度值比內參GAPDH的灰度值校正誤差，所得結果代表樣品的目的蛋白相對含量。以蛋白相對表達量檢測OSR對Formalin致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1蛋白表達的影響。

2.5統計學方法實驗結果采用SPSS11.5統計軟件包進行分析，數據采用形式表示，各組之間的統計學差異分析選用方差分析(One-way ANOVA)和t檢驗。

3 結果

3.1OSR對小鼠熱甩尾痛閾的影響Mor(40 mg·kg-1，ip)可使小鼠熱甩尾潛伏期明顯延長(P＜0.01)，作用持續90 min以上。與給藥前及NS組比較，OSR(500、250 mg·kg-1，iv)能明顯延長小鼠熱甩尾潛伏期(P＜0.05、P＜0.01)，鎮痛作用可持續60 min以上，最大痛閾提高率可達59.82%(Tab 1)。

3.2OSR對福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1mRNA表達的影響

3.2.1紫外分光光度法測定RNA濃度及純度所抽提的RNA光密度(OD)值A260/280均在1.8到2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見3條明顯的RNA 特征條帶:5 S、18 S、28 S，反轉錄所得cDNA 特異性強、質量好，GAPDH和GABAARα1定量PCR產物熔解曲線峰值均一、在反應曲線的其它位置未見到明顯波形(Fig 1～3)。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis result of total RNA in brain and spinal cord

Fig 2 Cumulative results of GAPDH and GABAARα1(n=7)

Fig 3 Solubility curve of GAPDH and GABAARα1(n=7)

3.2.2OSR對福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA表達的影響與 Formalin組比較，OSR(500.0mg·kg-1，iv)可明顯抑制福爾馬林誘導的GABAARα1 mRNA相對表達量的下調，提高小鼠脊髓和腦 GABAARα1 mRNA表達(P＜0.01)(Fig 4)。

Tab 1 Influence of OSR(iv)on the tail-flick latency in the warm water tail-flick test in mice(±s，n=10)

Tab 1 Influence of OSR(iv)on the tail-flick latency in the warm water tail-flick test in mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs pre-dose

NS 3.49 ±0.83 3.30 ±1.16 3.54 ±1.39 3.63 ±1.25 3.83 ±1.71 3.72 ±2.20 3.27 ±1.14 Mor 40.0 3.44 ±1.07 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 14.5 ±0.96＊＊##OSR 500.0 3.49 ±0.87 7.02 ±1.01＊＊##10.38 ±1.44＊＊##9.47 ±1.54＊＊##8.11 ±1.40＊＊##7.27 ±1.92＊＊##3.25 ±0.81 250.0 4.08 ±1.68 4.08 ±1.69 7.82 ±1.85＊＊##7.72 ±1.90＊＊##6.37 ±1.92＊＊##5.23 ±2.68*# 4.18 ±1.50 125.0 3.37 ±0.89 4.08 ±1.17 3.64 ±1.11 4.23 ±1.31 4.44 ±1.64*#4.07 ±1.73 3.23 ±0.78

Fig 4 Effect of OSR(500.0 mg·kg－1，iv)on GABAARα1 mRNA expression measured by quantitative real-time PCR(±s，n=7)

3.3OSR對福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1蛋白表達的影響與Formalin組比較，OSR(500.0 mg·kg-1，iv)可使小鼠脊髓和腦GABAARα1蛋白表達量明顯提高(P＜0.01)，提示OSR可明顯抑制福爾馬林誘導的GABAARα1蛋白表達量的下調(P＜0.01)(Fig 5～7)。

Fig 5 Agarose gel electrophoresis result of GABAARα1 protein expression in spinal cord

4 討論

Fig 6 Agarose gel electrophoresis results of GABAARα1 protein expression in brain

Fig 7 Effect of OSR(500.0 mg·kg－1，iv)on GABAARα1 Protein expression measured by Western blot(±s，n=7)

GABA是中樞神經系統中主要的抑制性氨基酸類神經遞質，廣泛存在于痛覺傳導通路上，通過與GABAA受體結合而開放其偶聯的氯離子通道，胞外氯離子內流增加使膜超極化，產生抑制性突觸后電位，進而引起包括鎮痛在內的多種中樞抑制作用［6～8］。電生理學實驗證明 GABA作用于 GABAA受體通過影響大鼠伏核中痛興奮神經元和痛抑制神經元的放電活動而產生鎮痛作用［9］，由GABAA受體介導的大鼠三叉神經節神經元GABA激活電流(IGABA)能被GABAA特異性拮抗劑荷包牡丹堿(Bicuculline，BIC)阻斷［10］。在脊髓以上水平有大量的GABA能神經元，它們在抗傷害性刺激和促傷害性刺激中有重要作用。GABA介導的神經元活動在中腦導水管周圍灰質腹外側區(PAG)和延髓頭端腹內側核群(RVM)的固有神經環路中可調節從PAG和RVM發出的內源性痛覺下行抑制系統的功能，而GABAA受體參與了其對內源性痛覺下行抑制系統復雜的調控作用。在大鼠的RVM或PAG給予GABAA受體興奮劑或拮抗劑可產生抗傷害或促傷害性刺激作用(即致痛敏作用)［11］。脊髓是接受疼痛信息的初級中樞，也是中樞對傷害性信息進行加工處理的重要部位，傳遞傷害性信息的Aδ類纖維和C類纖維多終止于此。GABA免疫陽性細胞在脊髓各層面都有表達，其中脊髓Ⅰ、Ⅲ層密度最高。本實驗結果與文獻報道［12］均顯示福爾馬林所致疼痛刺激可改變脊髓GABAA受體基因和蛋白表達，提示GABA受體系統在感覺和痛覺過程中起到調節作用。有研究表明，脊髓GABA能神經元的減少會減弱調節痛覺的抑制性信號的傳導，從而使痛覺傳導通路上脊髓神經元興奮性增強，引起神經痛。而神經痛早期給予GABAA受體激動劑，可減少異位放電向中樞傳遞，預防神經痛發生，提示GABAA受體激動劑作用于受損大鼠脊髓背根神經節對神經痛有一定的抑制效果［13-14］。

本實驗結果顯示 OSR(500.0、250.0 mg·kg-1，ith)能明顯延長小鼠熱甩尾潛伏期(P＜0.05、P＜0.01)，實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測結果顯示OSR(500.0 mg·kg-1，iv)可改善福爾馬林所致小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA和蛋白表達的減少 (P＜0.05，P＜0.01)。以上結果提示OSR具有明顯的鎮痛作用，小鼠脊髓和腦GABAARα1受體上調是OSR鎮痛作用的機制之一。關于中樞GABA能神經參與OSR鎮痛作用的詳細機制有待進一步研究。

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