免疫親和柱凈化光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法測定動物類藥材中黃曲霉毒素＊

楊小麗 ，韋日偉 ，申紅紅 ，楊美華 ，歐陽臻

(1.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193; 2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013;3.廣西中醫學院，廣西 南寧 530001)

黃曲霉毒素(AF)主要是由真菌黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)產生的毒性次生代謝產物，是一類具有強熒光性質的致癌、致畸的有毒物質，目前已確定的有黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2等 17 種[1]。由于黃曲霉毒素對人類身體健康的危害嚴重，許多國家、地區、國際組織已對其在食品中的限量標準作出了規定。近幾年來，歐盟加強了對黃曲霉毒素的控制，并實施國際上最嚴格的限量標準，規定在花生、干果、堅果以及谷類(包括蕎麥)中黃曲霉毒素B1限量為2 μg/kg，黃曲霉毒素總量(B1+B2+G1+G2)不得超過4 μg/kg[2]。動物藥是指動物的整體或動物體的某一部分、動物體的生理或病理產物、動物體的加工品等供藥用的一類中藥，如果藥材加工、貯藏、運輸不當，很容易發生霉變，受黃曲霉毒素污染[3]。黃曲霉毒素的檢測最初以薄層層析法為主，發展到現在已有高效液相色譜法、微柱法、超光譜法、化學免疫法等多種方法[4－6]。2010年版《中國藥典(一部)》規定柱后碘衍生高效液相色譜－熒光法對桃仁、胖大海、陳皮、僵蠶等幾味中藥材中的黃曲霉毒素進行測定，其黃曲霉毒素B1的限量為5 μg/kg，黃曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的限量為10 μg/kg[7]。筆者首次采用免疫親和柱凈化、光化學衍生后高效液相色譜－熒光法測定動物藥材中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，為動物類藥材中黃曲霉毒素限量標準的制訂提供參考。

1 儀器與試藥

LC－20 AT型高效液相色譜儀，RF－10AXL型熒光檢測器(日本島津公司);Aura Industries型光化學衍生器;ZD－9556型水平搖床(太倉市科教器材廠);Afla－P黃曲霉毒素免疫親和柱(美國Vicam公司);1.5 μm 玻璃纖維濾紙。黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2混合對照品溶液(美國 Suplco公司)，質量濃度分別為 1.0，0.3，1.0，0.3μg/mL);甲醇為色譜純;動物藥材均購于北京宏生堂藥店。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱∶ProntosilKromaplus型100－5－C18柱(250mm×4.6mm，5 μm);流動相∶甲醇 － 水 (45:55);流速∶1 mL/min;進樣量∶25 μL;柱溫∶25℃;檢測器∶熒光檢測器，激發波長 360 nm，發射波長440 nm。

2.2 樣品制備

準確稱取12.5 g粉碎的待測樣品，加入2.5 g氯化鈉和50 mL甲醇－水(80∶20)溶液，在水平搖床上振搖40 min，用定量濾紙粗濾，取10 mL濾液加40 mL純水，混勻。將上述稀釋后的濾液用玻璃纖維濾紙過濾，移取濾液20 mL(相當于1.0 g樣品)過Afla－P黃曲霉毒素免疫親和柱，調節流速為1滴/s，直至空氣完全通過免疫親和柱。用20 mL純水以2～3滴/s清洗免疫親和柱，直至空氣完全通過免疫親和柱。加入1 mL甲醇，調節流速至1滴/s，將免疫親和柱中的黃曲霉毒素淋洗下來。洗脫液用氮氣在40℃時吹干，用甲醇 －水(50∶50)定容至1 mL，振蕩混勻后，過0.45 μm有機濾膜，供測定用。

2.3 方法學考察

線性關系考察∶取混合對照品溶液(黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1質量濃度分別為 0.3，1.0，0.3，1.0 μg/mL)，配制成一系列(G1，B1)質量濃度為 1.0，2.5，5.0，15.0，25.0，50.0，75.0 ng/mL 的混合對照品溶液，分別進樣25 μL，記錄色譜圖。以黃曲霉毒素對照品溶液質量濃度為橫坐標(X)、峰面積積分值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，計算得回歸方程見表1。

表1 黃曲霉毒素的線性回歸方程、相關系數及線性范圍

精密度試驗:取混合對照品溶液，配制成黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1質量濃度分別為 3，10，3，10 ng/mL 的對照品溶液，連續進樣6 次。結果黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1峰面積的 RSD 分別為 0.6% ，0.2% ，0.6%，0.4%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗∶精密稱取同種空白樣品粉末12.5 g，共6份，分別精密加入混合對照品貯備液50 μL，按2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果各樣品中黃曲霉毒素4組峰面積的 RSD為1.3% ～ 5.6%(n=6)。

穩定性試驗∶精密稱取空白樣品粉末12.5 g，精密加入黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1質量濃度分別為 3，10，3，10 ng/mL 的對照品溶液，按 2.2項下方法制備供試品溶液，于配制后0，5，12，27 h時取樣分析。結果樣品中黃曲霉毒素4組峰面積的 RSD為0.3% ～3.4%，表明供試品溶液在27 h內基本穩定。

回收率試驗∶選取地龍、雞內金、蛇蛻3種空白藥材(分別屬于全動物類、臟器類、生理病理產物)分別代表常用動物藥的3種基質，且這3種藥材經過免疫親和柱處理之后進行檢測，對添加的對照品無干擾。本試驗添加了3個水平的混合對照品溶液，每個水平重復3次，計算平均回收率。結果見表2。

表2 不同樣品中黃曲霉毒素的回收率

檢測限∶在空白樣品中加入對照品，根據3倍信噪比的峰響應值，得出黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1的方法檢測限分別為 0.15，0.25，0.10，0.20 μg/kg。

2.4 樣品檢測

依法測定17種動物類藥材，包括水蛭(湖北)、全蝎(河北)、蜈蚣(湖北)、土鱉蟲(江西)、蘄蛇(湖南)、烏梢蛇(四川)、僵蠶(湖北 )、五靈脂(吉林)、夜明砂 (湖北 )、望月砂 (湖北 )、蟬蛻 (湖北 )、蛇蛻(湖南)、紫河車(湖北)、桑螵蛸(湖北)、龜甲(浙江)、鱉甲(浙江)、穿山甲(廣西)，其中僵蠶、土鱉蟲測定結果呈陽性(如圖1所示)。土鱉蟲中黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1含量分別為 0.9，4.1，0.3，1.1 μg/kg，總量達到6.4 μg/kg，有輕微污染;僵蠶中黃曲霉毒素G1含量為1 μg/kg，未檢出黃曲霉毒素 G2，B2，B1，污染水平低于2010年版《中國藥典(一部)》中的規定(黃曲霉毒素 B1不得高于 5 μg/kg，總黃曲霉毒素不得高于10 μg/kg)。

圖1 檢測限圖譜

3 討論

本試驗中，從高效液相色譜儀洗脫出來的樣品液流經光化學衍生器的網狀通路時，經紫外光照射，流動相光解出具有熒光特性的基團，與黃曲霉毒素B1和G1分子上的活性雙鍵發生羥基化反應，生成熒光特性更強、更穩定的物質，解決了黃曲霉毒素B1和G1在水溶液中的熒光淬滅現象[8]。光化學衍生裝置直接連在色譜柱和熒光檢測器之間，不需要在流動相中添加任何試劑，操作較簡易且靈敏度較高。

從樣品檢測結果可知，土鱉蟲中黃曲霉毒素總量達到6.4 μg/kg，超出藥典的限量標準。因此，動物藥材中黃曲霉毒素的污染應引起重視。

筆者首次采用免疫親和柱凈化、光化學衍生后高效液相色譜－熒光法測定動物藥材中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，這種方法不需要特殊的化學試劑和增加額外的泵，且靈敏度高、重現性好，適合動物藥材中黃曲霉毒素的快速定量分析，可為相關標準的制訂提供參考。

[1]楊美華.藥用植物及其產品中真菌及真菌毒素污染研究進展[J].貴州農業科學，2008，36(6):59 －63.

[2](EU)NO.165/2010，Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins[S].

[3]劉曉霞，傅武勝，吳錦忠.植物藥中黃曲霉毒素現代分析方法概況[J].海峽預防醫學雜志，2010，16(2):28－31.

[4]張愛婷.中藥黃曲霉毒素含量測定及限度標準的研究[J].光明中醫，2008，23(11):1 668 － 1 669.

[5]吳兆蕃.黃曲霉毒素的研究進展[J].甘肅科技，2010，26(18):89－92.

[6]黃惠明，徐群英，胡 敏.黃曲霉毒素檢測方法研究的概述[J].中國衛生檢驗，2001，11(4):510 －512.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄61.

[8]陳 新，王 雄，雷 達.免疫親和－光化學柱后衍生高效液相色譜熒光法測定花生粕中黃曲霉毒素的研究[J].中國飼料，2007，(24):30－34.