兩種方法用于HPV基因檢測的比較

王 攀 李招云 萬衛昌 石英英

(臺州市恩澤醫療集團中心醫院,浙江 臺州 318000)

宮頸癌的發生與HPV感染高度相關。有文獻報道,HPV的感染率在宮頸上皮內瘤變(CIN)I中為70%～78%,在CIN II～III中為80%～89%,在宮頸癌中則超過95%[1],因此HPV的檢測及在宿主癌變的預防中具有十分重要的意義,但如何在早期診斷子宮頸癌及癌前病變仍然是一個世界性的課題。目前,HC2技術是目前唯一被FDA批準在臨床應用的HPV DNA檢測方法[2],但在我國應用尚未普遍開展[3]。本文擬采用PCR結合反向雜交分析技術檢測HPV DNA,與HC2技術相比較,從而評估PCR結合反向雜交分析技術在檢測HPV感染篩查中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2009年3月～2010年5月門診患者和體檢健康者,共4252例,年齡18～69歲。

1.2 標本采集 用女性專用宮頸刷擦拭宮頸處,采集足夠的陰道分泌物,取出后放入洗脫管中,沿折痕處將宮頸刷柄折斷,旋緊洗脫管蓋,做好樣品標記,-20℃保存送檢。

1.3 儀器和試劑 PCR結合反向雜交分析試劑為亞能生物技術(深圳)有限公司產品(可檢測6、11、42 、43 、44 、16 、18 、31 、33 、35 、39 、45 、51 、52 、56 、58 、59 、66、68、73、83、MM423 種 HPV 基因型),HC2 試劑為美國 Digene 公司產品(可檢測 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、6813 種 HPV 基因型),LITTLE GENIUS基因擴增儀(LIFE EXPRESS),分子雜交(Combi-H12型),超速低溫離心機。

1.4 PCR結合反向雜交技術 操作按試劑盒說明書進行,主要有以下步驟:(1)DNA提取;(2)PCR擴增:擴增條件為 50℃15分鐘、95℃10分鐘,然后94℃30 秒 、42℃90 秒 、72℃30秒共 40 循環,再72℃5分鐘延伸;(3)雜交;(4)洗膜;(5)顯色。結果判斷:根據膜條上藍色斑點出現的相應位置即可判斷HPV的亞型為陽性,反之為陰性。

1.5 HC2技術 操作按試劑盒說明書進行,主要有以下步驟:(1)DNA提取;(2)雜交;(3)捕獲:第1抗體(特異性抗體)將RNA-DNA雜交復合物固定在微孔壁上;(4)信號放大:結合有堿性磷酸的多個第2抗體與RNA-DNA雜交復合物結合;(5)信號檢測。陽性結果判斷:檢測樣本的相對光單位(RlU)與標準陽性對照的RLU比值＞1.0。

1.6 統計學處理 所有數據用SPSS 10.0統計軟件進行分析,比較平行試驗結果用 χ2檢驗,檢測結果間的一致性用K檢驗,比較PCR結合反向雜交技術與HC2技術的結果用 χ2檢驗。

2 結 果

2.1 平行試驗結果 在364例樣本中,PCR結合反向雜交技術高危型陽性率31.6%(115/364);HC2技術陽性率29.4%(107/364)。兩種方法結果一致者326例,總符合率89.6%;不相符有 38例,其中PCR結合反向雜交技術檢測陰性23例,陽性15例,HC2技術檢測陰性15例,陽性23例。以HC2技術檢測結果為標準,根據 χ2檢驗和K檢驗,χ2=1.7,Kappa=0.93,得P＞0.05,兩者檢測結果無顯著性差異,見表1。

表1 PCR結合反向雜交技術與HC2技術檢測HPV方法的比較

2.2 分開試驗檢測結果

2.2.1 PCR結合反向雜交技術結果 2561例臨床標本中,其中HPVl3種高危型陽性者835例,陽性率32.6%。

2.2.2 HC2技術檢測HPV DNA的結果 1327例臨床標本中,共檢出陽性標本407例,檢出率為30.7%。

2.2.3 PCR結合反向雜交技術與HC2技術的結果比較,P＞0.05。兩者檢測結果無顯著性差異。

3 討 論

美國Digene公司的HC2技術是目前唯一獲得美國FDA認證和推薦可在臨床應用的HPV DNA檢測技術,已在世界范圍內用于HPV的篩查[3]。該法利用特異性的RNA探針和信號放大檢測方法,可以半定量檢測HPV病毒的DNA,并具有較高的靈敏度、特異性和重復性。但該法只能進行高危型和低危型的分類,不能進行基因型的分類,實驗中還存在高危型探針可與低危型探針發生交叉反應,除可與自身檢測的HPV類型外,還能夠與其他類型的HPV反應[4]。并且其成本較高,操作復雜,耗時長,不適合我國國情。因此尋找一種簡單、廉價、準確、快速、安全的檢測方法用于HPV的篩查是非常有必要的。

本試驗采用PCR結合反向雜交技術檢測HPV DNA,該方法是將多種探針固定在一條膜上,參與檢測的樣品DNA互不干擾,故能同時篩查多種不同類型的HPV基因型。因此,不僅簡化了檢測程序,縮短檢測時間,同時又能進行基因的分型。試驗結果表明,同時使用PCR結合反向雜交技術與HC2技術檢測364例標本,高危型陽性率分別為31.6%、29.4%,兩者比較無顯著性差異(P＞0.05),并具有良好的檢驗一致性;PCR結合反向雜交分析技術檢測2561例標本,高危型陽性率為32.6%,HC2技術檢測1327例標本,高危型陽性率為30.7%,兩者比較無顯著性差異。因此作者認為,PCR結合反向雜交技術同樣具備較好的靈敏性、特異性和重復性。

本文由于條件有限未開展確證實驗,故不能對兩者檢測的不同結果進行確證,無法得出PCR結合反向雜交結果的真陰性率和真陽性率。作者認為,理想的PCR結合反向雜交法的檢測探針應使其Tm值的變動盡可能的小,環境和操作污染的干擾更少,更簡化、完善檢測程序,具備更高的檢測靈敏性、特異性和重復性,使其更加適合應用于HPV DNA的臨床檢驗。

[1] Munoz N,Bosch F X,De Sanjose S,et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med,2003,348:518

[2] Shuhatovich O M,SharmanM P,Mirabal Y N,et al.Participant recruitment and motivation for participation in optical technology for cervical screening research trials.Gynecol Oncol,2005,99(3 Suppl 1):S226

[3] Lonky N M,Felix J C,Naidu Y M,et al.Triage of atypical squamous cells of undermined significance with hybrid capture II:colposcopy and histologic human papillomavirus correlation.Obstet Gynecol,2003,101:481

[4] 肖克林,王丁,周克元.HC2法在宮頸癌篩查中的應用現狀.國際檢驗醫學雜志,2008,29(4):364