ACL TOP 全自動血凝儀抗干擾能力評價

陸學軍，張將

1.衛生部北京醫院 檢驗科，北京100730；2.中南大學湘雅醫學院 檢驗系，湖南 長沙 410013

0 前言

1 材料和方法

全自動血凝儀已廣泛應用于臨床，具有高效、準確、簡便的優點，為手術前檢查、血栓與止血疾病診治、預后分析提供了較可靠的實驗指標，且較大地提高了工作效率[16，22]。但在日常工作中，我們會遇到外觀異常的標本，如溶血、脂血、黃疸標本，這些異常會干擾檢測，對檢驗結果造成一定的影響。為此，本實驗用干擾物對我科引進的Beckman-Coulter ACL-TOP血凝儀抗干擾能力進行評價。

1.1 材料

1.1.1 儀器

美國Beckman Coulter公司ACL TOP全自動血凝分析儀，Sysmex xs-800i全自動血細胞分析儀，日本奧林巴斯公司AU5400生化分析儀。

1.1.2 試劑

美國Beckman Coulter公司提供。① 凝血酶原時間測定試劑PT-FIB（批號0020003000）；部分凝血活酶時間APTT及Cacl2（批號0020006800）；③ 凝血酶時間TT（批號 0008469110）。

1.1.3 血漿

收集40名體檢健康人抗凝靜脈血各5mL，3000r/min離心10min，40份血漿等量混合后作為試驗血漿。正常值質控血漿（批號0020003110）和通用定標血漿（批號0020003700）由Beckman Coulter公司原裝進口。

1.1.4 干擾物

① 脂血：脂肪乳（主要成分為甘油三酯，華瑞制藥有限公司生產，批號：0510019），經已校準過的AU5400生化分析儀測定；② 黃疸：膽紅素標準品（上海科華公司生產，批號：GF62K），以總膽紅素含量表示，經已校準過的AU5400生化分析儀測定；③ 血紅蛋白：洗絳壓積紅細胞用蒸餾水稀釋，離心去除細胞碎片，保留血紅蛋白層，經已校準過的xs-800i血細胞分析儀測定。

1.2 方法

1.2.1 精密度試驗

從混合好的體檢健康人試驗血漿中取20份（每份500μL），于4h內在ACL TOP 血凝儀上參照儀器操作SOP文件測定PT、APTT、TT、FIB[1-4]，觀察其批內精密度；采用當月工作日內正常值質控血漿質控數據作日間精密度試驗結果。

1.2.2 準確性試驗

取l份定標（靶值）血漿重復測定5次。取平均值即為測定值。

1.2.3 干擾性試驗

根據美國國家臨床檢驗標準化委員會制定的“臨床化學干擾試驗”指南的要求，采取在體外添加干擾物于正常血漿中的方法制備待測標本[5-6,31]。為減少基質效應，3種干擾物分別用體檢健康人混合血漿配置（見表4）。終濃度分別為甘油三酯（TG）0～10.86mmol/L；總膽紅素（TBIL）0～416μmol/L；血紅蛋白（Hb）0～7.1g/L。在ACL TOP 血凝儀上測定PT、FIB、TT、APTT各2次，取平均值。記錄加入前后測定值的變化，以未加干擾物的混合血漿測定值為標準，計算出影響度，以影響度作為評價指標。影響度=[(加干擾物混合血漿測定值－未加干擾物混合血漿測定值)/未加干擾物混合血漿測定值]×100 %[12,33]。

1.2.4 測定方法

凝固（濁度）法測定；發色（吸光度）法測定；免疫學測定。

1.3 統計學分析

定標血漿與靶值比較采用單樣本t檢驗（SPSS 10.0統計軟件處理）。

2 結果

2.1 精密度試驗

測定PT、APTT、TT、FIB，結果見表l～2。(x±s)的批內精密度CV<4.0%，日間精密度CV <4.0%。

表1 PT、APTT、TT、FIB批內重復性試驗結果(x±s)

表2 PT、APTT、TT、FIB日間精密度試驗結果(x±s)

2.2 準確性試驗

測定標血漿5次，測定值與靶值差異無統計學意義(p>0.05)，見表 3。

表3 PT、APTT、TT、FIB準確性試驗結果(x±s)

2.3 干擾性試驗

ACL TOP測定加入各類不同濃度干擾物的試驗血漿PT、APTT、TT、FIB結果，與干擾物對照濃度（%）對比，HB、TBIL為干擾物時測得PT、APTT、TT、FIB的影響范圍在±8%之內。TG為干擾物時測得TT、FIB的影響范圍在±6%之內。TG在0～4.34mmol/L時，PT影響度為0～-13.5%；TG在6.52～10.86mmol/L時，PT影響度為-16.2%～-18.9%。TG在0～2.17mmol/L時，APTT影響度為0～-10.4%；TG在4.34～10.86mmol/L時，APTT影響度為-16.5%～-26.3%。詳見表4～7。

表4 各濃度干擾物混合血漿待測物配制法

表5 不同濃度血紅蛋白(Hb)對ACL TOP血凝儀測定結果的影響

表6 不同濃度總膽紅素(TBIL)對ACL TOP血凝儀測定結果的影響

表7 不同濃度甘油三酯(TG)對ACL TOP血凝儀測定結果的影響

3 討論

PT、APTT、TT和FIB是臨床凝血功能判斷的常規測定項目；是外科手術前凝血功能異常篩查的必查項目；是血栓前狀態的檢查、彌漫性血管內凝血出血疾病（DIC）的實驗診斷，以及對各種抗凝治療者的用藥指導和預后估計等的診斷項目，在臨床疾病診療中具有重要的價值[2,4,33]。目前市場已有多種凝血儀和試劑盒提供，使凝血功能檢測簡便、快速、實用，在臨床得到廣泛應用。當代最先進的血液凝固分析儀，能同時應用不同的實驗原理，對大量的標本進行多項指標的檢測；同時，儀器對標本和試劑的需求量比手工方法用量幾乎少一半，大大地降低了檢測的成本[7-8,12]。ACL TOP 血凝分析儀是一個可隨時加入標本進行檢測且專為血栓實驗室用于體外診斷而設計的平臺式全自動分析儀。它不僅具有高度自動化、快速檢測和操控界面先進的特點，還可同時采用凝固法、免疫比濁法和發色底物法檢測20多個凝血相關指標。檢測能力可達到360個PT測試/h或320個APTT測試/h或330個PT/APTT組合測試/h（165個APTT和165個PT測試）。它的高效率、大樣本分析能力，可為臨床提供凝血、抗凝、纖溶系統各項指標的分析檢測。可用于出血與血栓性疾病的診斷、抗凝藥劑量監測及預后分析[1,3,9,10]。

ACL TOP血凝儀使用于正常外觀血漿標本，測定PT、APTT、TT和FIB時變異系數都<4%，效果較理想。但在實際工作中會經常涉及到異常外觀血漿標本，如血漿中深淺不一的溶血和黃疸色澤、食糜含脂類或蛋白引起的混濁等干擾物質的物理性質影響血凝儀對血液凝固終點的判別，對測定方法起干擾效應[13-14]。為此，本人做了干擾性試驗，采用日本臨床化學學會的日本工業規格（Japanse industrialstandard，JIS）制定的“干擾物質的影響測試法”，并借鑒國際臨床化學委員會（IFCC）的“臨床化學中藥劑的影響”的方法和美國國立臨床檢驗標準化委員會（National Committee for Clinical Lab—Oratory Standard，NCCLS）制定的“臨床化學中干擾性測試指南”的檢測方法。試驗采取體外干擾物質影響試驗—添加試驗法。添加干擾物的最高濃度包括引起干擾影響物質的最高濃度。我們選用干擾物最終濃度為：Hb7.1g/L；TG10.86mmol/L；TBIL416μmol/L。為了在添加干擾物后使原試驗血漿的基質變化保持在最小限度，最好使添加干擾物的量與原試驗血漿相比保持在最低。IFCC認為，添加干擾物溶液量：原實驗血漿量為1:9 ；NCCLS則認為1:20 ；日本臨床化學學會則為1:9 ；本人采用1:9，各干擾物原始濃度為測試濃度的10倍。原試驗血漿9份加1份生理鹽水作為0干擾濃度，制成包括0濃度在內的6個不同梯度的添加干擾物質濃度，進行同步測定，實驗結果以測定秒值或mg/L值及影響度（%）評價[5-6,11,31]。為了排除含不同濃度的干擾物對原試驗血漿各項結果的影響，我們采用的干擾物為血清，而不是血漿。因血清中不含FIB，經檢測PT、APTT均延長超出檢測范圍，可認為不含凝血因子，而0干擾血漿加等量的生理鹽水。ACL TOP血凝分析儀采用先進光電散射光法同時配合本底掃描及免疫濁度測定原理，根據待檢樣品在凝固過程中散射光的變化并扣去原始血漿標本中原有色澤或濁度的百分比法來確定凝固終點的檢測方法，血漿同試劑快速離心混勻，在混合的瞬間，散射光最弱，從有散射光變化時將散射光強度置為0；隨著血漿纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，標本散射光強度也逐漸增加，當標本凝固完全以后，散射光的強度就穩定下來，此時散射光最強，光變化完全停止時將散射光強度確定為100[15-16,18]。如血漿含色澤或濁度時，其0的基線點會自動抬高；遇低纖維蛋白原血癥，則0的基線點會自動降低[3,9,17]。

試驗結果表明，ACL TOP血凝分析儀精密度較理想，批內和日間PT、APTT、TT、FIB的CV均<4.0%，具有良好的重復性和穩定性，滿足實驗室檢測要求，避免了手工操作所造成的誤差和不可靠性。血漿測定值與靶值相比較，差異無統計學意義（p>0.05），表明儀器測定的準確性良好。

對于干擾性試驗: ① 干擾物為Hb時，測定PT、APTT、 TT影響度在±3.5%之內，FIB影響度為0～-7.2%，遠小于美國CLIA'88提出的常見血凝儀分析指標質量要求（PT、APTT：靶值±15 % ；FIB：靶值±25 %）的標準[27-28]。② 干擾物為TBIL時，測定PT、TT、FIB影響度在±6%之內，APTT影響度為0～-7.6%，也較為理想。由①、②得知ACL TOP 血凝儀對溶血、黃疸標本有很強的抗干擾能力。③ 干擾物為TG時，測得TT、FIB的影響范圍在±6%之內。TG在0～4.34mmol/L時，PT影響度為0～-13.5%；TG在6.52～10.86mmol/L時，PT影響度為-16.2%～-18.9%，超出美國CLIA'88質量要求（PT:靶值±15 %）標準的范圍。TG在0～2.17mmol/L時，APTT影響度為0～-10.4%；TG在4.34～10.86mmol/L時，APTT影響度為-16.5%～-26.3%，超出美國CLIA'88質量要求（APTT:靶值±15 %）標準的范圍。由③得知TG對TT、FIB無干擾，而高濃度的TG干擾PT、APTT的檢測， PT、APTT隨TG濃度的升高愈加降低，影響度愈大。關于各檢測項目的干擾情況：TBIL對PT影響度（±0.9%）最小，Hb對APTT、TT影響度（前者為0～-3.2%，后者為±1.7%）最小，TG對FIB影響度（0～-4.3%）最小。

從測定結果可以看出，高脂肪乳糜對ACL TOP血凝分析儀測定PT、APTT的結果有明顯的影響，可使PT、APTT測定結果偏低，導致影響度增大且呈非規則的遞增性波動，對測定方法起干擾效應。這是由于：① 脂肪乳糜使血漿濁度過高，干擾測定過程，超過儀器檢測范圍時，導致儀器判定終點發生偏差不能檢測出結果或檢驗數據不準確。②本試驗主要測試的是對ACL TOP試劑的干擾，ACL TOP血凝分析儀配套試劑一個顯著的改變就是PT 、APTT試劑中的磷脂由人工合成， PT試劑中的組織因子采用基因工程重組技術制備[1,10,17]，推測TG可能會影響其中某些成分干擾測定[19-22]。常溫下采用高速離心（13000r/min，離心10 min）去除脂肪乳糜對血漿中凝血因子活性無影響。因此，常溫高速離心是一種簡便、易行的消除高脂肪乳糜對血凝分析儀測定結果的影響的方法[24,26,32]。另外，為減少脂血干擾誤差，對于抗凝藥物治療監測APTT的患者應空腹或固定的時間采集標本[25,30]。

綜上所述，ACL TOP 血凝儀對溶血、黃疸標本有很強的抗干擾能力。含低濃度TG（300μmol/L以下）的乳糜標本，對測定的影響度小，屬于在正常范圍內波動；但含有較高或高濃度TG的乳糜標本，對PT、APTT測定過程和結果的影響度較大，反映ACL TOP在一定濃度范圍內具有良好的抗乳糜干擾能力。這一結果不但給臨床醫生對病人的治療、判斷及預后提供了有效的血液凝固指標，而且為設定新的止血和血栓指標奠定了基礎[29]。

[1]Appert A,Fischer F,Jambou D,et al.Evaluation and performance characteristics of the automated coagulation analyzer ACL TOP[J].Thrombosis,2007,120:733-743.

[2]Dorn A,Dempfle C,Bertsch T,et al.Evaluation of the automated coagulation analyzer Sysmex CA-7000[J].Thrombosis,2005,116:171-179.

[3]Eschwege V,Catillon C,Robert A.Evaluation of the automated coagulation analyzer ACL TOP[J].Annales de Biologie Clinique,2006,64:259-264.

[4]Flanders M,Crist R,Safapour S,et al.Evaluation and performance characteristics of the STA-R coagulation analyzer [J].Clinical Chemistry, 2002,48:1622-1624.

[5]National Committee for Clinical Laboratory Standards.One-Stage Prothrombin Time (PT)Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT)Test;Approved Guideline[S].NCCLS Document H47-A(ISBN 1-56238-301-9).Wayne,PA:NCCLS,1996.

[6]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Procedure for the Determination of Fibrinogen in Plasma;Approved Guideline- Second Edition[S].NCCLS Document H30-A2(ISBN 1-56238-439-2).Wayne,PA: NCCLS,2001.

[7]Walenga JM,Fareed J.Automation and quality control in the coagulation laboratory[J].Clin Lab Med,1994,14:709-728.

[8]Fischer F,Appert A,Jambou D,et al.Evaluation of the automated coagulation analyzer Sysmex? CA 7000[J].Thromb Res,2006,117:721-729.

[9]Barnes PW,Eby CS.An evaluation of the performance characteristics of the ACL TOP? coagulation system[J].Clin Chem,2004;50(S6):A184.

[10]Ho DK,Lollo M,Reyes M,Garvey MB.A preliminary experience with the ACL TOP Hemostasis Testing System[J].Presentation at the ISLH XVIIIth International Symposium,San Francisco,CA,USA,May 2005.

[11]Clinical and Laboratory Standards Institute(formly National Committee for Clinical Laboratory Standards)[J].A framework for NCCLS evaluation protocols:A report.NCCLS document EP19-R.Wayne,PA:NCCLS,2002.

[12]程大衛,李敏霞,張威,等.CA 1500 型血液凝固分析儀的抗干擾功能[J]. 中華醫學檢測雜志,1999,22(5):309-311.

[13]Barnes PW,Eby CS.An evaluation of the performance characteristics of the ACL TOP Hemostasis Testing System.presentation at the AACC Meeting[M].Los Angeles,CA,USA,July 2004.

[14]Ziems J,Schulte M,Demant T.Clinical evaluation of the ACL TOP Hemostasis Testing System.Presentation at the 49th Congress of the German Society for Thrombosis and Hemostasis Research[J].February 2005,Mannheim,Germany.

[15]郝建華,呂斌斌,高旭紅,等.Stago Compact型血液凝固分析儀的抗干擾功能[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2002; 23(3):185-186.

[16]黃彬,陳茶,鐘武平.Sysmex CA 6000全自動血凝儀實驗性能評價[J].臨床檢驗雜志(特刊),2003,21:82-83.

[17]Milos M,Herak D,Kuric L,et al.Evaluation and performance characteristics of the coagulation system:ACL TOP analyzer-HemosIL reagents[J].Lab Hematol,2009,31(1):26-35.

[18]Curtin N,Highe G,Harris M,et al.Extensive evaluation of the insrumentation laboratory IL test D-Dimer immunoturbidimetric assay on the ACL 9000 determines the D-Dimer cutoff value for reliable exclusion of venous thromboembolism[J].Lab Hematol,2004,10(2):88-94.

[19]Quehenberger P,Kapiotis S,Handler S,et al.Evaluation of the automated coagulation analyzer SYSMEX CA 6000[J].Thromb Res,1999,96(1):65-71.

[20]Wehrum MJ,Hines JF,Hayes EB,et al.Comparative assessment of hypercoagulability in women with and without gynecologic malignancies using the thromboelastograph coagulation analyzer[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2010,21(2):140-143.

[21]Nam MH,Roh KH,Pak HN,et al.Evaluation of the Roche CoaguChek XS handheld coagulation analyzer in a cardiac outpatient clinic[J].Ann Clin Lab Sci,2008,38(1):37-40.

[22]施金俏.ACL 200 型血凝儀抗干擾能力探討[J].上海醫學檢驗雜志,2000,15(4):242.

[23]彭黎明,陸小軍.自動血凝儀的選型與評價[J].上海醫學檢驗雜志,2002,17(1):58.

[24]王春新,謝國強.ACL 200血凝儀的應用評價[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2005,26(3):189.

[25]陳麗,曹海芬.ACL 6000 全自動血凝儀的使用評價[J].江西檢驗醫學,2002;20(3):181-182.

[26]馬永能,張鵬,潘淑,等.ACL 8000型凝血分析儀的抗干擾功能[J].現代檢驗醫學雜志,2007;22(4):46-48.

[27]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline [S].NCCLS document EP7- A [ ISBN 1-56238-480 -5 ].NCCLS.940 West Valley Road,Suite 1400,Wayne,Pennsylvania 19087 -1898,USA,2002.

[28]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods;Approved Guideline-Second Edition[S].940 West Valley Road,Suite 1400,Wayne,Pennsylvania 19087-1898,USA,2004.

[29]唐寧,曹文靜,夏汛生,等.ACL TOP 全自動血凝分析系統的性能評價[J].醫療設備信息,2007,22(2):48-51.

[30]鄭衛東,范小斌,唐紅艷.STA-R全自動血凝儀性能評價[J].實用醫學雜志,2005,21(5):533-534.

[31]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Interference Testing in Clinical Chemistry .Proposed Guideline[D].EP7.Pennsylvania:NCCLS,1986,6:332-335.

[32]崔冬生,耿玉蘭,賀信祥,等.臨床乳糜血對凝血檢測項目的影響及處理[J].中國血液流變學雜志,2003,13(1):40-41.

[33]熊立凡,等.Sysmex CA1500 血液凝固儀的評價[J].中華醫學檢驗雜志,1999,22(6):383-384.