黃條金剛竹中總黃酮的提取及含量測定

丁 明，陳少妃，徐耀華

(浙江農林大學，浙江 臨安 313000)

黃條金剛竹 (Pleioblastus kongosanensis f.aureostriaus)，混生竹，稈高0.5～1 m，徑0.2～0.3 cm。葉片較寬大，綠色，不規則間有黃條紋，是北美箭竹超族北美箭竹族北美箭竹亞族大明竹屬大明竹亞屬，是大明竹屬金剛竹的一個變種。黃條金剛竹是一種觀葉竹種，非常美麗，觀賞價值高［1-2］。由田中辛南于1972年在名古屋市的守山鎮發現，1986年被引進南京林業大學竹種園，國內主要分布于浙江和江蘇［3］。

竹子中含有大量的黃酮類化合物和其他生物活性成分，如酚類、蒽醌類、香豆素類內酯、活性多糖、特種氨基酸等，其中黃酮是主要的有效成分并具有顯著的生理功能，如抗活性氧自由基、抗脂質過氧化、抗衰老、降低血脂、抗菌抑菌、增強免疫力等，而且竹葉黃酮安全無毒，其安全性大大高于銀杏提取物，由此竹葉黃酮類物質的提取純化及功能作用的研究已成為一個熱點［4-6］。目前，國內外對黃條金剛竹中所含黃酮情況尚未報到，經本組研究發現黃條金剛竹中總黃酮含量為0.44%～0.71%，雖比多數竹類總黃酮含量較低，但其具有生長速度快，可反復割采等特點，是一個相當豐富的潛在資源。

本文通過正交試驗考察了多種因素對于竹葉黃酮提取效果的影響，對總黃酮提取和含量測定進行研究，旨在為天然黃酮類物質的提取條件的優化提供有益的參數，為黃條金剛竹的開發利用提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

竹子樣品。分別于2010年6月1日和2010年8月3日采自浙江農林大學校園竹種園;竹子經過如下處理:洗凈，烘干，粉碎，過篩 (60目篩)，棕色磨口瓶保存備用。

試劑。蘆丁對照品 (中國藥品生物制品檢定所)，甲醇、乙醇、AlCl3、Al(NO3)3、NaNO2、CH3COOK、NaOH(均為分析純)，水 (Ⅰ級)。

儀器。CHA-S型恒溫振蕩器 (國華電器有限公司);PHS-4 A型智能酸度計 (上海虹益儀器儀表有限公司);DK-S22型數顯恒溫水浴鍋 (上海精宏實驗設備有限公司);FZ102植物試樣粉碎機(齊家務科學儀器廠);60目試樣標準篩 (浙江上虞華康化驗儀器廠);DF-101 S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (鞏義市予華儀器有限責任公司);SHZC型循環水式多用真空泵 (鞏義市予華儀器有限責任公司);DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 (上海森信實驗儀器有限公司);BS224 S電子天平(賽多利斯科學儀器 (北京)有限公司);T6紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的提取

稱取干燥粉碎的竹粉2.00 g置于潔凈的平底燒瓶中，加人30 mL 70%乙醇溶劑，放置24 h浸泡，然后移至恒溫水浴鍋浸提;提取條件:水浴恒溫，浸提1.5 h，經過2次浸提，將提取液轉入250 mL棕色容量瓶中定容，避光保存。

1.2.2 提取物的光譜測定

研究表明［7］，竹葉黃酮主要是黃酮糖苷，并以C-甙為主，4種主要的竹葉碳甙黃酮分別是葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷。

提取液的紫外/可見光譜圖。移取10 mL竹粉提取液于棕色50 mL容量瓶中，用乙醇補至18 mL，先加5%亞硝酸鈉溶液1.2 mL，搖勻，放置10 min;再加10%硝酸鋁溶液1.2 mL，搖勻 (溶液無色)，放置10 min，加入1 mol·L-1的氫氧化鈉8 mL，搖勻，此時溶液呈銅紅色。用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后。在波長200～800 nm、吸光度-0.020～5.000范圍內進行掃描，測其最大吸收波長 (λmax和吸收光度 D)，不加顯色劑做為對照。其結果見圖1所示，該提取物在240～280 nm和300～400 nm下有類似黃酮結構的特征吸收，且加入顯色劑后300～400 nm波長下有明顯減弱現行，可能為黃酮的酚羥基離解或形成絡合物等，導致光譜發生變化。由此我們推斷該提取液可能含黃酮類物質。

圖1 竹子黃酮提取物的紫外/可見光譜

1.2.3 總黃酮的測定

NaNO2-Al(NO3)3顯色法:取1 mL樣品置于10 mL的比色管中，用70%的乙醇補充至5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min后，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min后加入2 mL 1 mol·L-1NaOH溶液，并用30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置10 min，500 nm波長處分光光度計比色法測定。

1.2.4 標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁對照品0.010 0 g，置于小燒杯中，加70%乙醇溶液溶解后，移入100 mL容量瓶中，用乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用 (濃度為1.000 0 mg·mL-1)。

分取蘆丁標準溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于10 mL的比色管中，同時作空白。NaNO2-Al(NO3)3顯色法在波長500 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 方法的評價

2.1.1 標準曲線

以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標建立標準曲線，在0.100～0.600 mg·mL-1濃度范圍內，線性回歸方程為 D=1.098 9 C+0.001 5，R2=0.999 7。

2.1.2 精密度

準確吸取標準樣品溶液3.0 mL，同一樣品溶液1.0 mL各5份，同標準曲線操作和樣品測定的操作，測定吸光度值。結果表明，標準品吸光度值的RSD=0.25%，樣品吸光度值的RSD=0.50%，說明精密度良好 (表1)。

表1 各樣品的吸光度值

2.1.3 穩定性

準確吸取標準樣品溶液3.0 mL，同一樣品溶液1.0 mL，同標準曲線操作和樣品測定的操作，在0、15、30、45、60、90 min測定其吸光度值，結果 (表2)表明，標準品在90 min內穩定，樣品在45 min基本內穩定。

2.1.4 樣品加標回收率

準確吸取樣品溶液1.0 mL，分別加入蘆丁標準品 0.25、0.5、1.0 mL，按實驗方法測定吸光度，計算黃酮總量及回收率，結果 (表3)表明，該方法測定的結果比較準確，實驗結果見表4。

表2 各樣品不同時間的吸光度值

表3 各樣品的加標回收率

表4 正交試驗的因素及水平

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 取溶劑

據文獻報道［8-12］，竹葉黃酮一般為黃酮苷元難溶或不溶于水，易溶于醇類、氯仿、乙醚等有機溶劑或堿，根據它的結構特點以及物理和化學性質確定提取溶劑。利用甲醇、50%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯等不同溶劑提取 (2.00 g竹粉，30 mL溶劑，提取1 h)，結果D值分別為0.490，0.460，0.360，0.300和 0.320。其中甲醇的浸出效果最好，乙醇次之，丙酮和乙酸乙酯較差。這可能與溶劑的分子量小，極性大，容易滲透植物細胞壁等因素有關［13］。對于甲醇和乙醇比較而言，乙醇毒性更小，更安全，價格便宜，也易于回收，因此選用乙醇作浸提溶劑。

2.2.2 提取條件

根據單因素試驗結果，選擇液料比、乙醇體積分數、提取溫度和提取時間等4個因素，分別在各因素最佳條件前后各取1點組成3個水平，以提取物的吸光度為試驗指標，進行L9(34)正交試驗設計，試驗因素水平見表4。

根據表5的值分析可知，最好的試驗組合為A2 B2 C3 D1，即最佳提取條件為:液料比1∶15，乙醇體積分數為70%，提取溫度為80℃和提取時間為1 h。由極差R值可以看出，對提取效果影響最大的是因素A(液料比)，其次是因素B(乙醇體積分數)和因素C(提取溫度)，最小的是因素D(提取時間)。因此，在進行竹粉黃酮提取時，要對提取液料比和乙醇濃度加以嚴格控制，同時也要考慮到提取溫度和時間。

表5 各處理組合的吸光度值

2.3 黃條金剛竹提取物的總黃酮含量

分別采用上述方法對2010年6月1日和2010年8月3日采自浙江農林大學校竹種園同一采樣點的黃條金剛竹竹粉樣品進行測定。結果如表6所示。竹葉中黃酮總量為 5.9 ～13.1 mg·g-1［14-15］。而我們測定黃條金剛竹竹粉樣品含量為4.46～7.19 mg·g-1，由于竹粉樣品含較多竹枝條，因此竹粉總黃酮含量比竹葉總黃酮含量略低。此外，從2次間隔2個月的采集樣品發現，新生黃條金剛竹竹粉中黃酮含量為6.10 mg·g-1略低與老竹竹粉的6.71%，且8月份黃條金剛竹竹粉總黃酮含量為6.10 mg·g-1，明顯高于6月份黃條金剛竹竹粉的4.46%，這與文獻報道［15］新生竹葉黃酮含量高的報道不符。我們認為這可能是新生黃條金剛竹竹葉占整竹的比率較小所致。

表6 黃條金剛竹竹粉中總黃酮含量

由此可見，黃條金剛竹中具有較高的黃酮含量，由于黃條金剛竹生長速度快，其黃酮資源極具開發利用價值。

3 小結

本實驗對黃條金剛竹竹粉中的總黃酮進行了提取條件優化和含量測定，并初步分析黃條金剛竹竹粉中總黃酮含量，為進一步開發和利用黃條金剛竹資源的研究和評價提供了理論依據和檢測手段。

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