枯草芽孢桿菌a1所產抗真菌活性物質的穩定性研究

鐘嘯萍，熊智強，陳小龍

(浙江工業大學生物與環境工程學院發酵工程研究所，浙江 杭州 310014)

真菌引起的植物病害位居植物3類病害之首，其危害大于細菌病害和病毒病害［1］。目前對植物病害的防治普遍采用速克靈、百菌清、多菌靈等化學農藥［2-3］，而化學農藥對非靶標生物的毒害、對環境的污染、使有害物產生抗藥性的問題至今仍難以解決。化學農藥的殘留問題，更是極大的危害人類健康，引起了食品安全的信任危機。開發新型的廣譜、高效、低毒的生物農藥被認為是一條解決上述問題的有效途徑。

本實驗室以順丁烯二酸酐為基礎碳源，從土壤中分離得到的1株對灰霉病菌具有較強抑制作用的菌株a1，發現其具有較好的潛力開發成生物農藥，對其進行形態學、生理生化鑒定和16 SrDNA序列分析，確定其為枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis［4］。之后又對a1菌株所產抗真菌活性物質發酵條件進行了初步研究［5］。為了明確a1菌株發酵液的保存環境及分離純化活性物質的條件，我們對a1菌株發酵液在不同溫度，酸堿和光照條件下的穩定性進行了測定，其結果為開發新型生物源農藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

實驗室自行篩選的枯草芽孢桿菌a1(Bacillus subtilis a1)。

1.1.2 供試病原菌

番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea)和油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)均由實驗室提供。

1.1.3 培養基

PDA培養基:土豆200 g，葡萄糖200 g，水1 000 mL，pH自然。種子液培養基和發酵培養基均為PDA液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 發酵液的制備

從PDA斜面上刮下2環枯草芽孢桿菌a1到種子液培養基中，30℃、180 r·min-1培養24 h后，按5%的接種量接入發酵培養基中，30℃、180 r·min-1震蕩培養96 h。

1.2.2 抑菌活性的測定

采用生長速率法測定［6］。發酵結束后取30 mL發酵液置于15 000 r·min-1的離心機上離心 10 min，然后取上清液稀釋10倍。取1 mL稀釋液與9 mL的融化的PDA固體培養基混勻。待培養基冷卻凝固后，接種直徑為6 mm的供試病原菌菌餅，2～3 d后，測量菌圈直徑，計算抑菌率。用十字交叉法［7］測菌圈直徑。以無菌水作對照，做3個平行取平均值。

菌圈直徑 (mm)=實際測得菌圈直徑 -6，抑菌率 (%)=(對照菌圈直徑-處理菌圈直徑)/對照菌圈直徑×100。

1.2.3 確定抗菌物質產生部位試驗

從PDA斜面上刮下2環枯草芽孢桿菌a1到種子液培養基中，30℃、180 r·min-1培養24 h后，按5%的接種量接入發酵培養基中，30℃、180 r·min-1震蕩培養。發酵24 h后，取出25 mL發酵液用15 000 r·min-1離心機離心10 min。取上清液加入25 mL pH值為6.2的磷酸緩沖液稀釋后進行抑菌活性的測定。收集菌體，加入50 mL pH值為6.2的磷酸緩沖液，用超聲破碎儀進行破碎。然后再用15 000 r·min-1離心機離心10 min，取上清液測定抑菌活性。按上述方法分別測定發酵24，48，72和96 h時胞外產物和胞內產物的抑菌活性。

1.2.4 熱穩定性試驗

將發酵上清液分別置于60，80，100，120℃下處理20 min，然后冷卻至室溫，與室溫下的發酵上清液作比較，用生長速率法測定抑菌活性［8］。

1.2.5 pH值穩定性試驗

分別將發酵上清液的p H值從1調到14，處理12 h后，將這些發酵上清液離心10 min，15 000 r·min-1，然后將 pH調回初始 pH(pH值為6)，用生長速率法測定抑菌活性［9］。

1.2.6 紫外線穩定性試驗

將發酵上清液置于紫外燈下照射1，6，12和24 h，與未照射紫外光的發酵上清液作比較，用生長速率法測定抑菌活性。

1.2.7 光照穩定性試驗

將發酵上清液置于日光燈下照射1，6，12和24 h，與未照射的發酵上清液作比較，用生長速率法測定抑菌活性。

1.2.8 遺傳穩定性試驗

將a1菌株在PDA斜面上每隔2 d轉接1次，連續培養8代，然后每代分別發酵，最后測定各代發酵液的抑菌活性［10］。

2 結果與討論

2.1 抗菌物質產生部位的確定

從表1看出，枯草芽孢桿菌a1胞外產物和胞內產物均有抑菌活性，胞外產物的抗菌活性明顯高于胞內產物。所以枯草芽孢桿菌a1所產的抗菌物質主要存在于胞外。胞內產物和胞外產物有可能是不同的物質，這需要在進一步實驗中證實。

2.2 熱穩定性

a1菌株發酵液在不同溫度下處理20 min，隨著溫度的升高，發酵液的顏色變深，從室溫時的淡黃色變成120℃時的黃褐色。從表2可以看出，a1菌株發酵液在60℃和80℃下處理20 min的抑菌活性比室溫下有所下降，但仍保持有較高的抑菌活性。發酵液經過100℃處理，抑菌率有較大幅度的下降，對菌核病菌和灰霉病菌有一定的抑菌效果，在120℃處理下則完全喪失了抑菌活性。結果表明a1菌株的抗菌物質在80℃以下時穩定性較好。

表1 確定抗菌物質產生部位的試驗結果

表2 熱穩定性的試驗結果

2.3 pH穩定性

a1菌株發酵上清液在pH＜5時產生沉淀，隨著酸性的增大，液體渾濁度也增大，離心取沉淀后的上清液的抑菌活性明顯降低。沉淀加水后可重新溶解，且溶液經檢測后有一定的抑菌活性。當發酵上清液pH＞8時，上清液顏色變深，沒有產生沉淀，抑菌活性也大幅度下降。在pH為6和7時，發酵上清液顏色沒有變化，也沒有沉淀產生，而且有較高的抑菌活性。表3結果表明，a1菌株所產活性物質在堿性條件下不穩定，但具有很強的耐酸性。

2.4 紫外線穩定性

由表4可以看出，a1菌株的發酵液在紫外光下照射6 h后，它的抑菌活性沒有較大的改變。當紫外照射發酵液12 h和24 h后，活性物質對菌核病菌和灰霉病菌的抑菌率明顯下降。表明a1菌株所產物質在紫外光照下不夠穩定。

2.5 光照穩定性

從表5可以看出，a1菌株所產活性物質在光照條件下抑菌活性變化不大，與未光照時的抑菌活性相差無幾，表明a1菌株所產活性物質在光照下較穩定。

2.6 遺傳穩定性

從表6可以看出，a1菌株連續培養8代，其發酵所產物質對菌核病菌和灰霉病菌的抑菌率變化不大，到第8代仍有較高的抑菌活性，而且在實驗過程中觀察發現每代菌的形態特征都相同，無變化，表明a1菌株在連續傳代過程中比較穩定。

表3 pH穩定性試的驗結果

表4 紫外線穩定性的試驗結果

表5 光照穩定性的試驗結果

表6 遺傳穩定性的試驗結果

3 小結和討論

實驗結果表明，a1菌株的發酵液在酸性條件下能產生沉淀，且沉淀具有抑菌活性，這一特性為對活性物質進行分離純化提供了重要依據，但發酵液中的活性物質是否全部轉化為沉淀，還需要進一步研究。

a1菌株所產的抗菌物質能耐80℃的高溫，在光照和中性條件下活性穩定，在紫外光照射和堿性條件下不穩定。在保存a1菌株的發酵液時不需要避光，在分離純化抗菌活性物質時應注意避免在堿性條件和超過100℃的高溫條件下提取。枯草芽孢桿菌a1的遺傳性能相當穩定，連續傳8代其所產抗真菌物質活性沒有下降，這表明a1菌株具有作為發酵工業化生產菌的潛力。這些特性對以后研究該抗菌物質開發利用和工業化生產具有重要意義。

Bacillus subtili所產的抗菌物質種類的國內外報道很多，主要是一些高分子量蛋白類的抗菌物質［11］和伊枯草菌素之類的低分子量的抗菌肽［12-14］。而目前對這些抗菌物質的穩定性研究也很多，王啟軍等［15-16］研究的不同枯草芽孢桿菌所產的抗菌物質都是脂肽類化合物具有耐酸堿，熱穩定的特性。從類芽孢桿菌菌株B69發酵液中提取出 2種子新的抗菌物質 Pelgipeptin A和Pelgipeptin B，這2種子物質在60℃時處理2 h和pH值 1～8范圍內抗菌活性保持穩定［17］。Hammami［18］研究的枯草芽孢桿菌14 B所產的類蛋白抗菌物質可耐121℃高溫，在pH 1到8范圍內保持穩定的抗菌活性。本研究的結果與Xue-Chang Wu的結果有相似之處，都不耐堿和100℃以上的高溫，因此，a1菌株所產抗菌物質有可能是Pelgipeptin A和Pelgipeptin B，但目前的試驗還無法判斷a1菌株所產抗菌物質的種類，也可能是還未報道過的新抗真菌化合物，下一步研究重點集中在分離純化抗真菌活性物質及鑒定它的分子結構。

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