多殺菌素生產菌種保藏方法的研究

漏佳偉，傅盼翰，裘娟萍

(1.浙江工業(yè)大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學 健行學院，浙江 杭州 310014)

多殺菌素 (spinosad)是刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)有氧發(fā)酵產生的次級代謝產物，是一種安全、高效、廣譜的大環(huán)內酯類殺蟲劑，其主要有效成分是多殺菌素A和D［1-3］。實驗證明多殺菌素能有效防治害蟲，尤其對鱗翅目、纓翅目害蟲有極強的選擇性毒殺作用［4-7］。多殺菌素的殺蟲作用具較強的靶標性，對煙芽夜蛾等重要農業(yè)害蟲的殺蟲活性遠遠超過常用的多種有機磷類、環(huán)戊二烯類、氨基甲酸酯類殺蟲劑，對非靶標生物的毒性很低，對包括人在內的哺乳動物非常安全［8-9］，迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)與其他殺蟲劑有交叉抗性［10-11］。國內外對于多殺菌素的物理化學性質、作用機理和毒性、殺蟲譜、分析檢測方法和發(fā)酵工藝都做了大量的研究，但由于菌種在保藏過程中易退化，產量極不穩(wěn)定，導致國內多殺菌素依然沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產。為此，研究刺糖多孢菌的穩(wěn)定性，找到維持產量穩(wěn)定的保藏方法，對實現(xiàn)多殺菌素工業(yè)化生產具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

刺糖多孢菌5個菌株 (本實驗室保存菌種)，其特性列于表1。

表1 待保藏菌株的典型特性

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基。葡萄糖0.9%，MgSO4·7 H2O 0.2%，酵母膏0.3%，玉米漿1.0%，瓊脂2.0%，pH值7.0

種子培養(yǎng)基。葡萄糖1.0%，酵母膏0.4%，蛋白胨 0.4%，MgSO4·7 H2O 0.05%，KH2PO40.002%，K2HPO40.004%，p H值7.0

發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖7.0%，蛋白胨2.5%，CaCO30.5%，玉米漿1.5%，大豆油4.0%，棉籽粉2.5%，p H值7.0。

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器有:gilent 1100 series液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1 R離心機 (美國熱電公司)，SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 (上海博訊實業(yè)有限公司)，PYX-DHS-40×50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海市躍進醫(yī)療器械一廠)，ZHWY-2112B雙層特大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智誠分析儀器制造有限公司)，SW-CJ-1F超凈工作臺 (蘇凈集團安泰公司)。

試劑，多殺菌素標樣 (菜喜)(美國陶氏益農公司)。

1.4 方法

1.4.1 菌種斜面低溫保藏

將菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d，置于密封盒中4℃低溫保藏。

1.4.2 菌種凍干管保藏

帶棉塞的安瓿管滅菌備用。脫脂牛奶間歇滅菌備用。在培養(yǎng)好的斜面中加入無菌脫脂牛奶制成孢子懸液，分裝于安瓿管中，每管4～5滴。將安瓿管預凍至-30℃左右，置于冷凍機內進行冷凍真空干燥直至水分被抽干，繼續(xù)抽真空凍干30 min。在真空條件下熔封，用高頻電火花真空測驗器檢查真空度，真空管放入密閉容器，4℃低溫保藏［12］。

1.4.3 菌種沙土管保藏

河沙過80目 (0.177 mm)篩，用20%鹽酸浸泡24 h后棄鹽酸，水洗至中性，將沙子烘干備用。取非耕作層瘦黃土 (不含有機質)，研碎后過100目 (0.149 mm)篩并用水洗至中性，烘干備用。將處理后的沙、土按質量比3∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管中，每管0.35 g，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30 min，無菌檢驗合格后烘干備用。需保藏菌株斜面培養(yǎng)，以無菌水制成孢子懸液滴入沙土管中，每支沙土管4至5滴 (剛剛使沙土潤濕)，塞好棉塞，低溫真空抽去水分。在真空條件下熔封，用高頻電火花真空測驗器檢查真空度，真空管放入密閉容器，4℃低溫保藏［12］。

1.4.4 菌株產孢能力測定

菌種保藏30，90，180，270 d，將各保藏菌株用斜面活化，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌薹上的孢子形成情況。

菌種保藏180，270 d后，用無菌生理鹽水將沙土管和凍干管中的菌株制成單孢子懸液，適當稀釋后涂布平板，30℃恒溫培養(yǎng)7 d，各菌株挑取10個大小相似、呈火山口型的典型單菌落至斜面，凍干管菌株分別標記為1、2、…、10，沙土管菌株分別標記為a、b、…、j。在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌薹上的孢子形成情況。

1.4.5 菌株死亡率檢驗

將安瓿管中的孢子移至裝有無菌生理鹽水的試管中，振蕩打散，制成單孢子懸液，用血球板計數(shù)法測定孢子總數(shù)。將孢子懸液適當稀釋后涂布于平板上，每組3個平板。30℃恒溫培養(yǎng)7 d，記錄菌落形成單位數(shù)。菌株死亡率的計算公式:死亡率(%)=(孢子總數(shù)-菌落形成單位數(shù))/孢子總數(shù)×100。

1.4.6 菌株耐藥性檢驗

將一定濃度的紅霉素、乙酸鈉分別加入固體培養(yǎng)基中，制成平板，再將菌株劃線接種至加藥平板與不加藥物的對照平板上，于30℃下培養(yǎng)10 d，觀察菌株生長情況，計算其典型遺傳特性保持率。計算公式:典型遺傳特性保持率 (%)=抗性平板菌株數(shù)/對照平板菌株數(shù)×100。

1.4.7 菌株搖瓶發(fā)酵條件

菌株用種子培養(yǎng)基30℃、220 r·min-1培養(yǎng)48 h，取3 mL種子液接種至含30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d。

1.4.8 高效液相色譜法測定

參照張苑的方法［13］，色譜柱:Agilent XDB C18;流動相:甲醇∶乙腈∶0.05%的乙酸鈉水溶液為 45∶45∶10(V∶V);流速:1.0 mL·min-1;進樣量:20 μL;柱溫:室溫。

菌株相對效價 (%)=菌株產量/原始菌株產量×100，默認原始菌株產量為100%;產量下降率 (%)=(原始菌株產量-菌株產量)/原始菌株產量×100。

2 結果與討論

2.1 保藏方法對刺糖多孢菌不同菌株產孢能力的影響

2.1.1 保藏30 d

保藏30 d，菌薹上的孢子形成情況見表2。

表2 保藏30 d各菌株的孢子形成情況

分析表2可知，保藏30 d，斜面保藏法對菌株產孢子的能力影響最小，凍干管保藏法和沙土管保藏法對其影響基本相同，均有減弱趨勢。

2.1.2 保藏90 d

保藏90 d，菌薹上的孢子形成情況見表3。

表3 保藏90 d各菌株的孢子形成情況

分析表2和3可知，保藏90 d，斜面保藏的菌株產孢能力退化嚴重，凍干管和沙土管保藏的菌株產孢能力與保藏30 d的情況基本一致。由此說明，斜面保藏法不適用于長期保藏。

2.1.3 保藏180 d

保藏180 d，菌薹上的孢子形成情況見表4。

表4 保藏180 d各菌株的孢子形成情況

分析表4可知，保藏180 d，斜面保藏的菌株存活率為零，凍干管和沙土管保藏菌株生長狀況明顯減弱，產孢能力退化嚴重。

對比表2、3和4中菌株的生長及孢子形成情況可知，隨著菌株保藏時間延長，菌株的生長及孢子形成能力均嚴重退化。

沙土管和凍干管中的菌株分離純化后菌薹上的孢子形成情況見表5和表6。

表5 凍干管保藏180 d各菌株分離純化株的孢子形成情況

表6 沙土管保藏180 d各菌株分離純化株的孢子形成情況

對比表5和表6可知，同種保藏方法對不同菌株的保藏效果差異明顯，說明不同菌株的抗逆性不同。凍干管保藏法對菌株的生長及產孢能力影響較小，大部分菌株生長較旺盛。菌株54的分離純化株產孢能力最強，與其原始典型特性 (表1)相符。

對比表4、5和6中菌株的生長及孢子形成情況可知，若先經(jīng)平板分離純化，挑取健壯單菌落至斜面，則菌株的生長狀況相對旺盛，產孢能力強。這說明孢子的初步分離純化可達到一定程度的復壯效果。菌株54的產孢能力提高幅度最大，L2其次，其余3個菌株較小。

由此可知，菌株的產孢能力不僅受保藏方法的影響，而且與保藏時間的長短、菌株本身的特性等因素有關。

2.1.4 保藏270 d

保藏270 d沙土管和凍干管中的菌株分離純化后菌薹上的孢子形成情況見表7和表8。

表7 凍干管保藏270 d各菌株的孢子形成情況

表8 沙土管保藏270 d各菌株的孢子形成情況

對比表7和表8可知，凍干管和沙土管保藏法對菌株產孢能力的影響基本相同。其中，菌株54的產孢能力強。

分析比較表5和表7、表6和表8可知，隨著保藏時間的延長，菌株的產孢能力下降。

2.2 保藏方法對菌株死亡率的影響

保藏180 d、270 d計算菌株死亡率，結果見圖1、圖2。

圖1 凍干管保藏法對菌株死亡率的影響

圖2 沙土管保藏法對菌株死亡率的影響

從圖1和2可以看出，保藏180 d、270 d，各菌株的死亡率都大于90%，特別是沙土管保藏的菌株，死亡率都接近100%。對比圖1和圖2，凍干管保藏菌株死亡率相對較低，保藏效果相對較好。這說明脫脂牛奶作保護劑的效果比無保護作用的沙土好。

對比同一菌株保藏180 d和270 d的死亡率，可見隨著保藏時間的延長，菌株的死亡率增加，但增加的幅度較小，說明菌株對干燥和低溫敏感，在保藏過程中大部分孢子在180 d前死亡。

2.3 保藏方法對菌株典型遺傳特性的影響

分別配制含紅霉素濃度25 U·mL-1、35 U·mL-1，含乙酸鈉濃度10 mg·mL-1、25 mg·mL-1的抗性平板，將保藏270 d的分離純化株劃線接種至相應抗性平板和不含藥物的對照平板上，30℃條件下培養(yǎng)10 d，觀察菌株的生長情況，結果見表9。

表9 各菌株在藥物及對照平板上的生長情況

根據(jù)表9中各菌株的生長情況，計算菌株典型遺傳特性保持率，結果見表10。

表10 保藏方法對菌株典型遺傳特性的影響

分析表10可知，不同保藏方法對同一菌株同一遺傳特性的保持率不同。菌株4用凍干法保藏時，紅霉素抗性穩(wěn)定，但用沙土管保藏時，紅霉素抗性丟失。菌株H25用凍干法保藏時，紅霉素抗性穩(wěn)定，但用沙土管保藏時，50%的菌株已丟失抗性。由此說明凍干管保藏法能更好地保持菌株的遺傳特性。同一菌株同一保藏方法對不同遺傳特性的保持能力也不同，2種保藏方法都導致菌株4失去乙酸鈉抗性的性狀，但紅霉素抗性卻未完全失去。由此說明乙酸鈉抗性比紅霉素抗性更不穩(wěn)定。

2.4 保藏方法對菌株產多殺菌素能力的影響

2.4.1 保藏180 d

保藏180 d，各凍干管、沙土管分離純化株中斜面生長狀況良好的菌株進行搖甁發(fā)酵，發(fā)酵結束測定p H值，用HPLC法測定發(fā)酵液中多殺菌素的含量，結果見表11。比較各菌株與原始菌株的生產多殺菌素的能力，結果見表12。由表11和12可知，凍干管保藏法分離純化株的產量比較穩(wěn)定，不同菌株間相對效價差異不明顯，平均產量下降率均在85%左右。而沙土管保藏分離純化株的產量不穩(wěn)定，不同菌株間相對效價差異明顯，產量下降率最高的菌株Y20-180-i及最低的菌株54-180-h均出現(xiàn)在沙土管中。此外，沙土管保藏菌株4-180-c的產量最高，達到131.06 mg·L-1。

表11 保藏180 d各分離純化株的發(fā)酵結果

表12 保藏180 d各分離純化株產多殺菌素能力與原始菌株的比較

2.4.2 保藏270 d

保藏270 d，各凍干管、沙土管分離純化株發(fā)酵液中多殺菌素的含量見表13。比較各菌株與原始菌株的生產多殺菌素的能力，結果見表14。對比表12和14可知，隨著保藏時間的延長，同一保藏方法同一菌株產多殺菌素的能力不斷退化，部分菌株甚至失去產多殺菌素的能力。由表13和14可知，保藏270 d，2種保藏方法對菌株產多殺菌素能力的影響均較嚴重，但菌株差異明顯。菌株H25用凍干管保藏時，產多殺菌素能力已全部喪失，用沙土管保藏時卻未喪失。說明不同保藏方法對同一菌株產多殺菌素能力的影響不同。

表13 保藏270 d各分離純化株發(fā)酵結果

表14 保藏270 d各分離純化株產多殺菌素能力與原始菌株的比較

3 小結

斜面保藏法操作最簡單，保藏30 d，活化菌株生長最旺盛，產孢能力最強;保藏90 d，菌株完全喪失產孢能力。用凍干管和沙土管保藏法保藏270 d，菌株產孢能力、產多殺菌素能力和部分遺傳特性仍能保持;但隨著保藏時間的延長，部分遺傳特性失去，菌株產孢子和產多殺菌素的能力嚴重下降。與沙土管保藏法相比，凍干管保藏法對菌株產孢子、產多殺菌素的能力以及對其遺傳特性的影響較小，死亡率較低，菌種產量較穩(wěn)定。但產量最高的菌株以及相對效價最高的菌株均出現(xiàn)在沙土管中，2種保藏方法的保藏效果因菌株不同而差異明顯。

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