慢性乙型肝炎和肝硬化患者外周血單個核細胞分泌TIMP-1的研究

王恩波,丁榮梅,李興華

(連云港市第一人民醫院輸血科,江蘇連云港222002)

本研究通過對慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清和單個核細胞中組織金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的分析,探討TIMP-1在肝纖維化中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇 病例組為2006年7月至2008年7月在我院住院的患者,慢性乙型肝炎63例,其中男42例,女21例,平均年齡39(20-69)歲;乙型肝炎肝硬化47例,男27 例,女 20例,平均年齡56(41-77)歲,診斷按2000年9月中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的標準進行臨床分型,所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒合并感染。對照組是體檢健康且乙型肝炎標志物陰性40例,男25例,女15例,平均年齡35(27-48)歲。

1.2 主要試劑和儀器 Ficoll淋巴細胞分離液購于CEDARLANE,1640細胞培養液購于GIBCO,胎牛血清購于杭州四季青公司,刀豆蛋白A(ConA)購于SIGMA公司,組織金屬蛋白酶抑因子1和轉化生長因子β1 ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。MCO-17AC CO2培養箱(SANYO)。

1.3 外周血單個核細胞的分離和培養 抽取健康對照、慢性乙型肝炎和肝硬化患者靜脈血5 ml,應用Ficoll分離液密度梯度離心分離PBMC,用1640培養基洗滌PBMC3次,每次800 rpm/min離心10分鐘,用1640培養基調整細胞濃度至2×106/ml,取細胞懸液加入96孔平底細胞培養板中,200 μ l/孔,每個標本加3個復孔,每孔加入刀豆蛋白A至終濃度5 μ g/μ l,37℃5%CO2培養箱中共同孵育72 h后,收集細胞培養上清液檢測TIMP-1的含量。

1.4 血清TIMP-1、TGF-β1和細胞培養上清液中TIMP-1的含量檢測 應用博士德人組織金屬蛋白酶抑因子1 ELISA試劑盒檢測血清和細胞培養上清液中TIMP-1的含量,博士德人轉化生長因子β1 ELISA試劑盒檢測血清TGF-β1的含量。

1.5 統計學分析 數據應用SPSS14.0統計軟件包分析處理,均數的比較采用兩獨立樣本t檢驗,數據以±s表示;PBMC中 TIMP-1含量與血清TGF-β1的關系采用二元變量的相關分析。

2 結果

2.1 血清和PBMC培養上清中TIMP-1蛋白含量的比較 見表1。

表1 血清和PBMC培養上清中TIMP-1蛋白含量

2.2 血清 TGF-β1含量、血清 TIMP-1與 TGF-β1含量相關性分析 慢性乙型肝炎組(12.05±2.62)ng/ml和肝硬化組(13.91±3.04)ng/ml兩組血清TGF-β1蛋白含量均明顯高于正常對照組(6.15±2.31)ng/ml;血清TIMP-1與TGF-β1含量呈明顯正相關(r=0.71,P＜0.01)。

3 討論

慢性乙型肝炎病人血清TIMP-1升高主要是由于長期慢性肝臟炎癥,TGF-β1、IL-1、TNF-α等合成和分泌增加,這些炎癥因子促使了TIMP-1的表達,尤其是肝臟損傷時,肝星狀細胞(HSC)通過自分泌或旁分泌的方式產生大量的TGF-β1,激活的TGF-β1通過與細胞膜上的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結合發揮作用,促使Ⅰ、Ⅲ型膠原,纖維連接蛋白及其mRNA均呈劑量依賴性增加,同時TGF-β1通過促進HSC分泌TIMP-1抑制膠原酶的mRNA的表達進而減少ECM的分解,在我們檢測的慢性肝臟病病人中,血清TGF-β1含量明顯增高。張連峰[1]等人檢測了慢性乙型肝炎患者血清TGF-β1和TIMP-1在肝纖維化不同階段的表達情況,通過肝穿刺對肝纖維化進行病理分級,發現血清TGF-β1、TIMP-1在肝纖維化早期即明顯升高,且隨肝纖維化程度的加重 TGF-β1、TIMP-1逐漸升高,因此認為血清TIMP-1含量對肝纖維化的診斷中具有較高的價值。Fontana[2]等人建立了包含血清TIMP-1、HA和血小板個數的三變量數學模型,在診斷肝硬化時,ROC曲線下面積達到0.81,診斷價值明顯優于APRI(曲線下面積為0.73)和肝硬化積分(曲線下面積為0.70)等模型,多變量分析提示血清TIMP-1、HA含量與肝臟纖維化Ishak積分呈正相關,血清TIMP-1、HA與肝臟膠原直接定量分析相比更能準確的反應肝臟纖維化的程度。

對外周血單個核細胞培養上清液TIMP-1含量檢測表明,單個核細胞合成的TIMP-1含量較低,且慢性乙型肝炎和肝硬化組單個核細胞培養上清TIMP-1含量與正常組比較,差別無顯著性意義,進一步證明血清中的TIMP-1主要來源于活化的HSC,對大鼠慢性肝損傷的研究表明[3],TIMP-1的持續高表達與HSC的持續激活相關。總之,在慢性肝臟疾病患者中,外周血單個核細胞分泌的TIMP-1未發生明顯改變,而血清TIMP-1水平有助于肝臟纖維化的診斷。

[1]張連峰,田笑笑,王春峰.轉化生長因子β1和基質金屬蛋白酶抑制因子-1在肝纖維化診斷中的作用及關系[J].中華肝臟病雜志,2007,15(4):258.

[2]Fontana RJ,Goodman ZD,Dienstag JL,et al.Relationship of serum fibrosis markers with liver fibrosis stage and collagen content in patients with advanced chronic hepatitis C[J].Hepatology,2008,47(3):789.

[3]Iredale JP,Benyon RC,Arthur MJ,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 messenger RNA expression is enhanced relative to interstitial collagenase messenger RNA in experimental liver injury and fibrosis[J].Hepatology,1996,24(1):176.