吸煙對男性精液質(zhì)量、精漿活性氧及精子凋亡率的影響

孫啟玉,李 劍,韓迎春,薛承巖,關(guān)會臻,謝守軍,張茉莉,張秀琴*

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 a.檢驗科;b.普外科,河北 承德067000;2.隆化縣醫(yī)院 放射科)

吸煙對男性生殖能力的影響,特別是對精液質(zhì)量的影響,近年來已引起社會的廣泛關(guān)注。我們選擇在我院就診不孕患者及健康成年男性作為研究對象,對其精漿活性氧及精子凋亡率進行檢測,以探索吸煙影響精液質(zhì)量的機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

120例男性不育患者為2006年9月至2009年7月來我院就診病例,均為婚后2年以上,未采取任何避孕措施,性生活正常,排除女方不孕原因的不育男性,身體健康,無大量飲酒和長期接觸有害物質(zhì)史,無生殖道感染和精索靜脈曲張史等。不育非吸煙組研究對象的納入標準:不吸煙且無被動吸煙史。不育吸煙組研究對象根據(jù)吸煙習慣和煙齡分為3組:A日吸煙量＜10支,且煙齡≤1年;B日吸煙量10-20支,且煙齡5-10年;C日吸煙量≥20支,且煙齡≥10年。根據(jù)納入標準,不育吸煙組有63人,其中A組19人,B組22人,C組22人。正常對照組選用35例已生育正常健康體檢男性,無吸煙史,無泌尿、生殖、造血及內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病。

1.2 標本采集

禁欲2-7天后通過手淫取精于無菌廣口瓶中,置37℃恒溫箱中液化。液化后取部分精液25℃下,3 000 r/min離心15min,取上清液即精漿-20℃保存待測。

1.3 精液常規(guī)參數(shù)測定

按WHO手冊推薦的標準方法檢測精液量、粘稠度、液化時間、pH值等指標。采用CASA系統(tǒng)(北京偉力公司W(wǎng)LJY9000)檢測精子總數(shù)、精子密度、精子活率和活力。

1.4 精漿丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量測定

采用南京建成生物技術(shù)工程有限公司生產(chǎn)試劑盒測定,按試劑盒說明書操作,用分光光度計讀取吸光度值。

1.5 精子凋亡的檢測

試劑:TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒由南京凱基生物技術(shù)有限公司提供;TritonX-100由北京拜爾迪生物公司提供。

方法:標本液化后,取10 μ l滴于多聚賴氨酸防脫玻片上,以推血片的方法制作精液涂片;浸入4%多聚甲醛中固定25 min,-20℃的乙醇中放置2 h;PBS漂洗3次,每次5 min;浸入封閉液,室溫15-25℃封閉10 min;PBS漂洗 3次,每次5 min;浸入通透液中,冰上(2-8℃)促滲 2 min。PBS漂洗兩次,樣本周圍用吸水紙吸干;每個樣本滴加50 μ l TdT酶反應液,加蓋玻片37℃避光濕潤反應60 min;PBS漂洗3次,樣本周圍用吸水紙吸干;滴加 50 μ l Streptavidin-HRP-工作液,加蓋玻片37℃濕潤避光反應30 min;PBS漂洗 3次;滴加50 μ l DAB工作液,室溫顯色反應10 min;PBS漂洗3次,光學顯微鏡下檢測。每張涂片隨機取10個油鏡視野(×1 000),計數(shù)凋亡精子數(shù)和精子總數(shù),以凋亡精子數(shù)/精子總數(shù)×100%表示凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件,兩組間計量資料比較采用t檢驗,計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對照組、不育非吸煙組及不育吸煙組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率測定結(jié)果見表1 三組年齡比較無明顯差異。不育非吸煙組及不育吸煙組精子密度、精子活率、a+b級精子百分率和精漿MDA含量低于正常對照組(P＜0.05),精子凋亡率顯著高于正常對照組(P＜0.05)。不育吸煙組和不育非吸煙組比較精子密度、精子活率、a+b級精子百分率、精漿MDA含量顯著下降(P＜0.05),而精子凋亡率顯著增高(P＜0.05)。

2.2 A B C三組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率測定結(jié)果見表2 三組年齡比較無明顯差異。B組精子密度、精子活率、a+b級精子百分率、MDA含量低于A組,但統(tǒng)計學上無明顯差異。B組精子凋亡率和A組相比也無統(tǒng)計學差異。C組精子密度、精子活率、a+b級精子百分率、MDA含量顯著低于A組和B組(P＜0.05)。C組精子凋亡率顯著高于A組和B組(P＜0.05)。

表1 各組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率的比較

表2 不同吸煙量各組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率的比較

3 討論

近年來,吸煙與男性不育的關(guān)系日益受到關(guān)注,但吸煙對精子質(zhì)量的影響各家報道不一。可能與吸煙者未能準確提供煙量、起始時間及某些未知的不育因素等有關(guān)[1]。本研究對健康男性、不育吸煙患者及不育非吸煙患者的研究結(jié)果顯示不育吸煙患者的各精液參數(shù)值明顯下降,且大煙量組精液質(zhì)量下降最為明顯。表明吸煙影響男性精液質(zhì)量,并存在一定的量-效關(guān)系。

目前,吸煙對精液的作用機制尚不完全清楚。香煙中含有尼古丁、可尼丁、苯并α-芘、一氧化碳、鎘等大量的有害物質(zhì)。對男性的生殖功能的影響是多方面的。吸煙能使男性體內(nèi)激素水平發(fā)生改變,與不吸煙者相比,吸煙男性血清中卵泡刺激素、雌二醇水平顯著上升[2]。吸煙可以增加精液DNA的氧化損害。與不吸煙者相比,吸煙者精液DNA中的8-OhdG(DNA氧化損傷后的一種產(chǎn)物)增加50%,而維生素E的濃度下降32%[3]。長期重度吸煙還可干擾睪丸及附睪微循環(huán)和內(nèi)環(huán)境的物質(zhì)交換,影響睪丸生精細胞的發(fā)育過程,阻礙精子的發(fā)生和成熟[4]。

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和男性生殖的關(guān)系已得到廣泛研究。在男性生殖道中,抗氧化酶系統(tǒng)和非酶性抗氧化物成分使ROS的產(chǎn)生和清除保持動態(tài)平衡。適量低濃度的ROS在精子獲能和頂體反應中有著重要的生理作用,但過量活性氧存在可導致細胞氧化應激損傷,使精子的活力下降、死亡率升高,并影響精子的頂體反應及受精功能,是導致男性不育的重要原因之一[5]。MDA作為活性氧與細胞多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應的主要產(chǎn)物,是脂質(zhì)過氧化損傷嚴重程度的指標。MDA為極活潑的交聯(lián)劑,可迅速與磷脂酰乙醇胺交聯(lián)成熒光色素后與蛋白質(zhì)、肽類或脂類結(jié)合成難溶的無生理活性的脂褐素沉積于細胞漿內(nèi),使細胞功能老化,從而使精子受到損傷,運動能力下降。因此通過檢測丙二醛可了解活性氧的濃度。

本研究結(jié)果顯示不育吸煙患者MDA含量顯著高于不育非吸煙患者。C組MDA含量顯著高于B組和A組。表明吸煙可以增加精漿活性氧含量,并且吸煙量越大,時間越長產(chǎn)生的活性氧含量越高。同時本研究結(jié)果顯示不育吸煙患者精子凋亡率顯著高于不育非吸煙患者,且C組最為明顯。精子凋亡是精子受損的直接表現(xiàn),可以反映吸煙對精子細胞的損傷情況。長期大量吸煙導致精子凋亡率顯著增加是其增加精漿活性氧含量加重氧化應激損傷的嚴重后果。

由于吸煙可以增加精漿活性氧含量,加重損害精子細胞,導致精液質(zhì)量顯著下降,吸煙可以加重不育患者的病情,同時吸煙也可能是導致不育的唯一因素。對于成年男性尤其是育齡男性,我們應加強宣傳力度,提倡不吸煙或戒煙,積極創(chuàng)造條件消除吸煙對人類健康的危害。

[1]武俊青,高爾生.吸煙對男性生殖功能的影響[J].生殖與避孕,2006,26(12):745.

[2]Ochedalski T,Lachowicz O A,Dec W,et al.Examining the effects of tobacco smoking on levels of certain hormones in serum of young men[J].Ginekol Pol,1994,65(2):87.

[3]Fraga CG,Motchnik PA,Wyrobek AJ,et al.Smoking and low antioxidant levels increase oxidative damage to sper m DNA[J].Mutat Res,1996,351(2):199.

[4]Agarwal A,Saleh RA,Bedaiwy MA.Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction[J].Fertil Steril,2003,79(4):829.

[5]Agarwal A,Sharma RK,Nalljella KP,et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility[J].Fertil Stefil,2006,86(4):878.