C14orf48基因在人精液精子中的表達和生物信息學分析

李如凱,郭龍華

(1.深圳市石巖人民醫院 檢驗科,廣東 深圳518036;2.廣東省中醫院 檢驗科,廣東 廣州510120)

根據世界衛生組織(WHO)的統計資料,全世界范圍內不孕不育癥占育齡夫婦的20%左右,其中男性因素導致不孕不育的約占50%[1]。導致男性不育的原因很多,如遺傳因素、營養缺乏、心理因素等,而弱精子癥(Asthenozoospermia)或精子活動力低下被認為是導致男性不育的重要原因。有報道,82%的男性不育與精子活動障礙有關,其中20%左右與精子活動力低下直接相關[2]。弱精子癥的發生機制現在還不清楚,其發生的分子機制一直是人們研究的重點。在人和哺乳動物的精子中大概含有2000多個轉錄本和一系列復雜的蛋白,這些蛋白在精子運動、獲能和頂體反應中發揮著重要作用[3-6]。目前已經證實了一些基因與精子運動有關,其中某些基因在弱精中的表達顯著降低,是弱精發生的原因,如:可溶性腺苷酸環化酶(sAC)[7,8]、鈣離子通道(Catsper)、芳香化酶、睪丸特異蛋白-1(Testis-specific protein1)和乳酸脫氫酶C(Lactate dehydrogenase C)[6]。對于調控精子運動關鍵基因的研究有助于揭示弱精精子癥患者的發生機制,為臨床弱精子癥患者的治療提供有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與處理

精液標本來源于廣東省中醫院及深圳市石巖人民醫院的門診病人。嚴格按照世界衛生組織標準,篩選正常人精液(精液量2-6 ml,呈灰白色或淡黃色,pH7.2-7.8,30-60 min全部液化,精子密度≥20×106/ml,精子活力A級≥25%或A+B級≥50%,正常精子形態≥50%,白細胞＜1×106)和弱精子癥患者精液(精子活力A級＜25%或A+B級＜30%)。為避免圓形細胞(生精細胞和白細胞)的污染,按文獻方法[5],將液化后的精液經Percoll(95%,76%,57%和47.5%)非連續梯度離心(300×g,25 min),收集95%Percoll以下和57%與76%Percoll層之間的精子。磷酸鹽緩沖液洗滌2次(600×g,5 min),儲存于-80℃備用。同時選取含有睪丸生精細胞和白細胞的精液標本作為C-KIT(生精細胞標志物)和CD45(白細胞標志物)的陽性對照。人對心 、肝 、脾 、肺 、腎 、胃 、腦 、睪丸組織來源于病人活檢、手術或遺體捐獻,患者年齡24-40歲,均有患者及家屬簽定的知情書,并經本院倫理委員會批準。

1.2 Affymetrix芯片分析

用基因芯片方法來比較正常男性和弱精子癥患者精液精子表達譜差異,篩選差異表達基因。人的全基因組芯片(GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0,Affymetrix Comp)涵蓋了47000轉錄本,代表了38500多個已經明確的基因和EST序列。將純化后精子的cDNA探針與Affymetrix全基因組芯片雜交。芯片購自美國Affymetrix公司,所以實驗操作過程參考該公司實驗手冊。

1.3 生物信息學分析

NCBI做序列分析和Blastn同源性比較(http:WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。蛋白質序列分析采用DNAstar軟件。亞細胞定位預測用PSORT II Prediction(http://psort.ims.u-tokyo.ac.ip/form2.htm1)。

1.3 半定量RT-PCR

采用Primer Premer5.0軟件自行設計引物,并以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參對照。為了避免基因組DNA的污染,上下游引物分別設計在不同的外顯子上(引物由上海生工合成)。引物序列如下:人 C14orf48,上游引物 5′-CCGTTTCGGTCTGTC TTC ATCC-3′,下游引物 5′-CCGAATAAACGCCCATAGCAG-3′,擴增產物大小225 bp;GAPDH:s上游引物 5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′, 下 游 引 物 5′-GAGTCCTTCCACGATACCA-3′,產物為 307 bp 。

取離心后精子,按照RNAfast200 Kit(上海飛捷)提取總RNA。紫外分光光度計定量后于-80℃儲存備用。采用反轉錄反應試劑盒(Fermentas公司,美國)進行逆轉錄,按照說明書中方法合成cDNA第一鏈,以該鏈cDNA為模板,用上述引物對其進行PCR擴增。在20 μ l的反應總體積中加入以下物質:cDNA(500 ng/20 μ l):2 μ l,引物(10 pmol/L):0.4 μ l,10×PCR buffer:2.0 μ l,MgC12(25 mmol/L):1.6 μ l,dNTP(10 mmol/L):0.4 μ l,TaqDNA 聚合酶(1 μ/μ l):1 μ l。PCR反應條件為:94℃4 min,94℃30 s,56℃40 s,72℃35 s,共35個循環,72℃5min,1.5%的瓊脂糖檢測PCR產物大小。

2 結果

2.1 Affymetrix芯片結果

Affymetrix芯片探針為1570111-at的雜交信號校正值在正常男性和弱精子癥患者精液精子中分別是141.2(P)和2.8(A)。A:Absent,表示在基因芯片中不表達;P:Present,表示在芯片中表達。可見1570111-at探針所代表的基因在弱精子癥患者精液精子中不表達,在正常男性精液精子中高表達。以GAPDH為內對照,其芯片雜交信號校正值分別是209.2(P)和209.1(P)。

2.2 cDNA序列和蛋白特性的預測

1570111-at探針代表的基因登錄號為BC031252.1,NCBI做Blastn分析發現,與登錄號為NR-024182的cDNA序列有100%的同源性。NR-024182 cDNA全長1 952 bp,基因名稱為C14orf48,定位14q32.12,含有9個外顯子。用NCBI做Unigene分析發現該基因的EST序列只在在睪丸組織中檢測到,人其他44個組織或者器官中檢測相對量均為0,說明該基因具有睪丸表達特異性。生物信息學預測該基因編碼140個氨基酸、分子量為15.808 kD的功能未知蛋白質Q8NCU1。亞細胞定位預測該基因在細胞質(39.1%)和細胞核(34.8%)中表達。

2.2 C14orf48在精液精子中的RT-PCR結果

正常男性和弱精子癥患者組各選20例精液精子進行RT-PCR反應,均沒有檢測出C-KIT(生精細胞標志物)和CD45(白細胞標志物),表示純化結果良好,沒有白細胞和不成熟精子的污染。RT-PCR結果顯示,弱精子癥患者精液精子中沒有檢測到C14orf48表達,而該基因在正常男性精液精子中則表達強烈。內參GAPDH在正常和弱精子患者中表達沒有差異。如圖1所示。

圖1 C14orf48在正常男性(N)和弱精子癥患者精液精子中的表達(A)

2.4 C14orf48多組織RT-PCR結果分析

在人 8種組織(心 、肝 、脾、肺 、腎 、胃、腦 、睪丸)RT-PCR結果表明,C14orf48基因在睪丸中呈現特異性表達,能夠看到225 bp的PCR產物。而其他組織中均不表達(圖3)。陽性內對照GAPDH均有特異性RT-PCR產物。

圖2 C14orf48人多種組織的RT-PCR結果

3 討論

弱精子癥(精子活動力低下)是男性不育癥最常見的精液異常改變之一,因其病因復雜,目前尚未有明確有效的治療方法,多以內分泌治療和輔助生育技術為主要方法而達到男性生育的目的。目前認為,與精子運動相關的幾個生理過程是保證男性正常生育的重要基礎,(1)精子尾部的大體形態和亞細胞結構;(2)精子的能量代謝,包括糖酵解和氧化磷酸化,此過程產生ATP;(3)調控精子運動的信號傳導通路,包括cAMP/PKA信號傳導通路,鈣信號傳導通路,小G蛋白信號傳導通路[9,10]。根據以上分析可以推測弱精子癥的發生可能是以上某個環節發生問題所導致的結果。

本實驗通過比較弱精子癥患者和正常男性精液精子的基因表達譜,找到了差異基因C14orf48,該基因在弱精子患者中的表達明顯缺失,并通過PT-PCR的方法進一步得到驗證。生物信息學分析結果顯示該基因僅在睪丸中特異性表達,在人類其他44種組織中不表達,RT-PCR結果表明在人8種組織中僅在睪丸組織中表達。因此推測C14orf48基因的表達產物可能通過以上三種機制參與的精子運動,該基因在弱精子癥患者精液精子中的表達缺失可能是弱精子癥發生的原因之一。目前該基因的功能未知,進一步研究該基因的生物學功能,對于揭示人類弱精子癥的發生機制具有重要意義。

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