代謝型谷氨酸受體、谷氨酸轉運體的基因表達與糖尿病腦損傷的相關性分析

張滿英,景 影*,李 蕊,畢經瑞,孫連坤,婁長芹

(1.吉化集團公司總醫院,吉林吉林市132022;2.吉林大學白求恩醫學院 病理生理教研室)

谷氨酸是中樞神經系統興奮性突觸傳遞的主要神經遞質,維持正常腦功能,但較高濃度谷氨酸則具有神經毒性作用[1],中樞神經系統內含有大量興奮性氨基酸[2],幾乎所有的神經元都含有谷氨酸受體,隨著分子生物學技術的發展,到目前已克隆出8種mGluRs,分別命名為 mGluR1-mGluR8,mGluR1-3,mGluR5-7的腦保護作用已被證實[3],由于mGluR-4、mGluR-6受體分布的局限性及缺少對不同亞型受體選擇性作用的藥物,它們與腦損傷及神經保護劑的作用還需進一步證實。

糖尿病是缺血性腦血管病的危險因素,高血糖對缺血性腦卒中的病情和轉歸有負面影響[4]。目前關于糖尿病腦損傷時代謝型谷氨酸受體及谷氨酸轉運體基因表達方面報道較少,本研究著重觀察糖尿病腦損傷大鼠代謝型谷氨酸受體、谷氨酸轉運體基因的表達情況,探討他們在腦保護方面的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組 清潔級近交系Wistar大鼠28只,雌雄不限,重約160-200 g,購自吉林大學實驗動物中心。STZ、戊巴比妥鈉購自Sigma公司。鼠隨機分成A(常規飼料喂養組,n=14)、B(高糖高脂飼料喂養+STZ注射誘導胰島素抵抗,即模型組,n=14)二組,自由進食水,12 h光照周期。

1.2 試劑與儀器 PCR擴增儀、PCR熱循環儀、DL2000DNA Marker、Taq DNA聚合酶均產自TAKARA公司,日本;RNA定量儀,SANYO,日本;PCR引物合成由聯星公司,中國;兔抗大鼠胰島素多克隆抗體,麥新公司,美國。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立

高糖高脂飼料喂養大鼠飼養一個月后,B組大鼠一次性腹腔注射60 mg/kgSTZ(以pH4.2的11 mol/L枸櫞酸緩沖液配成125%濃度)誘導糖尿病,A組僅注射枸櫞酸緩沖液作對照。測定血糖。血糖測定采用葡萄糖氧化酶法。血標本在1%戊巴比妥麻醉下(30 mg/kg)從眼內眥靜脈取,EDTA抗凝。胰腺組織胰島素染色:常規方法處理玻片,脫蠟,3%H2O2孵育 25 min,阻斷內源性過氧化物酶,PBS洗 5 minx3,正常羊血清50 μ l/片滴于組織片上封閉非特異蛋白,室溫下孵育20 min,封閉非特異位點,FITC(中山公司)發色,視顯色強度而定時間。

1.4 PCR 檢測 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA表達

取凍存的6個月糖尿病鼠腦組織100 mg,加入1 ml Trizol,用勻漿機把組織攪碎,室溫放置5 min,使其充分裂解。離心、沉淀、干燥后提取細胞總RNA,經逆轉錄成cDNA,用相關基因的引物擴增其基因的片段,觀察mRNA表達情況。反應條件:循環1 95℃5 min,循環 2 94℃30 s,56℃1 min,72℃1 min,30循環 ,循環 3 72℃ 10 min。EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6引物序列分別為:正義5'-CCCGGAAGAACCCCTGGGTTT-3',反義 5'-GTTCATT GTCCTG GGCAATCA-3',PCR產物572 bp;正義 5'-TGAGCTACGTGCTGCTGGCG-3',反義 5'-TGTCGGCTGACTGTGAGGTG-3',PCR產物 329 bp;正義 5'-CAAGTAGCAAGGTTGAGTGT-3'反義5'-GGTTGTAGTGTTGGATCAAG-3'PCR產物280 bp。

1.5 統計學方法

各組數據采用mean±SD表示,統計學處理采用SPSS11.5軟件分析,各實驗組間均值比較采用ANOVA。

2 結果

2.1 大鼠空腹血糖濃度

模型組空腹血糖20.016±1.984 mmol/L,對照組空腹血糖3.882±0.123 mmol/L(P＜0.01),模型組空腹血糖明顯高于正常(＜7.0 mmol/L),符合糖尿病診斷標準。

2.2 大鼠胰腺組織胰島素染色

激光共聚焦顯微鏡下觀察組織中胰島素表達,照相。結果顯示對照組胰腺組織中可見大量胰島細胞,糖尿病模型組胰腺組織中胰島細胞顯著減少。

2.3 PCR檢測大鼠腦皮質 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA的表達

反應結束后,進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像分析系統中觀察并照相記錄。RT-PCR結果顯示:糖尿病模型組mGluR-6 mRNA表達與對照組相比明顯增強(P＜0.05),而 EAAT-1、mGluR-4 mRNA表達與對照組相比略有增強,但未見統計學意義。

圖1 胰腺組織胰島素染色

圖2 RT-PCR檢測大鼠腦皮質 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA的表達

3 討論

糖尿病合并腦損傷已成為當前嚴重危害人類生命與健康的常見因素[5],其發病后癥狀重、預后差、死亡率高,給社會和家庭帶來的沉重影響越來越得到學者的關注,腦損傷的發病機制仍不很明確,研究認為可能主要與糖尿病代謝紊亂所致的微血管、大血管病變以及血液流變學和抗凝纖溶系統異常有關[6]。

為探討糖尿病合并腦損傷的發病機制,我們對復制的糖尿病大鼠模型從分子生物學角度在腦神經代謝方面進行相關檢測和對照研究,旨在為闡明糖尿病腦損傷的機制及為臨床預防和治療糖尿病并發腦損傷提供科學的依據。

本實驗是對通過飲食誘導胰島素抵抗的大鼠一次性STZ注射,誘發產生糖尿病模型,客觀真實的模擬腦損傷的過程,符合臨床發病規律。經胰島素染色和血糖測定結果證實糖尿病動物模型是成功的。

本研究提示:6個月糖尿病大鼠腦皮質內代謝型受體mGluR-6表達增加,說明mGluR-6可能在糖尿病腦損傷的發生發展過程中扮演著一個重要的角色,本研究認為糖尿病鼠腦谷氨酸釋放增多,導致與腦缺血、缺氧及變性疾病有關的興奮毒作用[7],mGluR-6可減少或阻斷突觸前谷氨酸的釋放,減少缺血引起的腦組織損傷,起到腦保護作用,為進一步探索腦損傷機制及神經保護提供了理論依據。

[1]虞希沖.谷氨酸轉運體、谷氨酸/胱氨酸轉運體與神經細胞毒作用[J].中國臨床藥理學與治理療學,2003,8(5):490.

[2]周雯慧.谷氨酸、NMDA受體和新生兒缺氧缺血性腦損傷[J].國外醫學婦產科分冊,2004,31(1):17.

[3]Ferraguti F,Shigemoto R.Metabotropic glutamate receptors[J].CellTissue Res,2006,326(2):483.

[4]王 瑩,張朝東.糖尿病與缺血性腦血管病的相關性[J].中國臨床康復,2003,7(31):4276.

[5]Aronow WS,AhnC.Risk factors for new atherothrombotic brain infarction in older Hispanic men and women[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2002;57(1):61.

[6]吳 毅,吳軍發.2型糖尿病患者的康復治療與評價[J].中國臨床康復,2002,6(15):2202.

[7]Hoogeveen EK,KostensePJ,JakobsC,et al.Hyperhomocy steine increased risk of death,especially in type 2diabetes[J].Circulation 2000,101:1506.