siRNA抑制人膠質瘤細胞MDM2的表達及細胞增殖

張舵舵,趙燕穎,張 妍,劉 玲,高振平*

(1.吉林大學基礎醫學院,吉林長春130021;2.吉林大學中日聯誼醫院;3.吉林大學第四臨床醫院;4.延邊大學醫學部)

膠質瘤是顱內最常見的腫瘤,大多數膠質瘤惡性程度高,侵襲性強,手術不易完全切除,術后復發率高,病人預后不良。p53蛋白具調節細胞生長和誘導凋亡的作用,MDM2作為一個癌基因主要是抑制野生型p53的激活轉錄功能和抗腫瘤活性。研究發現MDM2蛋白的過度表達導致同時表達的p53蛋白量減少導致腫瘤的發生[1]。研究報道MDM2癌基因在肉瘤、膀胱癌、膠質瘤、肺癌等都有過度表達[2]。本研究體外合成特異性針對MDM2基因的siRNA,研究siRNA對MDM2基因的阻抑作用和對人膠質瘤細胞的生長增殖抑制作用,為膠質瘤的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SilencerTM siRNA construction kit(Ambion公司);LipofectamineTM 2000轉染試劑盒(Invitrogen);胎牛血清、IMDM 培養基(Gibco公司);MTT、RT-PCR kit(Promega)、引物由上海生工生物技術公司合成;U251細胞株(中國科學院上海細胞所)。

1.2 siRNA的設計和合成

根據已知Genebank中MDM2mRNA序列和siRNA的設計原則[4],利用Ambion公司的在線設計來尋找靶序列,并做同源序列搜索,排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列,用silencerTM siRNA construction kit體外合成si-MDM2-1,si-MDM2-2,陰性對照control siRNA購于Ambion,與任何編碼序列無同源性。

1.3 細胞培養 人膠質瘤細胞株U251細胞IMDM培養液(10%胎牛血清,青霉素100 μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml)中,37℃、5%CO2孵箱內培養。常規更換培養液、消化傳代,實驗所用細胞均處于對數生長期。

1.4 細胞轉染 對數生長期細胞在無抗生素的培養基中培養細胞融合率達80%-95%時開始轉染。操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行。分四組轉染:空白對照組(只加轉染試劑),轉染陰性對照質粒和轉染兩個siMDM2質粒組,瞬時轉染后提取細胞RNA以備后續實驗用。

1.5 半定量RT-PCR 收集轉染48 h后各組細胞,分別提取總RNA,紫外分光光度計定量。RNA樣品經逆轉錄反應合成cDNA,然后進行PCR擴增。MDM2擴增產物為450 bp,上游引物為:5′-AATCATCGGACTCAGGTA-3′,下游 引物為:5′-CTTCACTAAGGCTATAATCTTC-3′;β-actin擴增產物為 520 bp,上游引物為 :5′-GGGACCTGACAGACTACCT-3′下游引 物為:5′-CGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。擴增 條件:94℃變性45秒,56℃退火45秒,72℃延伸1分鐘,30個循環,最后72℃延伸10分鐘。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠系統電泳(含溴化乙啶),拍照鑒定。用Pharmacia ImageMaster凝膠成像儀觀察,并用ImageMaster軟件分析條帶峰面積。

1.6 MTT檢測細胞增殖抑制率 以5×103/孔將對數生長期細胞接種于96孔板,培養至細胞貼壁后轉染(分組同上),轉染質粒組使其終濃度達50 nmol/L,轉染 24、48 、72 h 后,每孔加入 15 μ L MTT(5 mg/ml)培養 4 h,再加入150 μ L/孔的 DMSO,振蕩 10分鐘,用酶標儀570 nm處測定吸光度(A)值。根據公式:細胞增殖抑制率(%)=(1-處理組吸光度/未處理組吸光度)×100%,計算出抑制率。每組均設4個平行孔,重復3次。

1.7 流式細胞術檢測凋亡 取對數生長期細胞按7.5×105/瓶接種到培養瓶,分組同上。培養72 h后消化收集細胞,用冰冷PBS洗2次,制備成單細胞懸液,用冰冷70%乙醇固定過夜,碘化丙啶染色,流式細胞儀檢測凋亡率。

2 結果

2.1 重組質粒酶切和測序鑒定 構建的Si MDM2真核表達質粒經HindⅢ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定,電泳結果為大片段的載體片段和63 bp的目的片段,與預計片段長度相同(圖1)。將重組質粒PGCsilencerTM-MDM2-siRNA送上海生工測序,序列完全與目的序列相同,表明siRNA MDM2構建成功。

圖1 重組質粒雙酶切鑒定

2.2 半定量RT-PCR 以β-actin作為內參照,對靶基因mRNA進行定性定量分析,MDM2和β-actin引物的擴增基因片段經電泳后,結果顯示擴增片段大小分別為450bp和520bp。轉染siMDM2-1,2組MDM2 mRNA表達明顯減少,而轉染陰性質粒組MDM2 mRNA表達水平無明顯改變。半定量掃描分析,轉染si-MDM2-1 si-MDM2-2中MDM2-mRNA的表達量分別下降至對照組的31.61%,40.18%(P＜0.05);陰性對照質粒組的MDM2-mRNA表達為對照組的97.9%,與空白對照組無明顯差異(P＞0.05)。(圖2)

圖2 比較轉染PGCsilencerTM-MDM2-siRNA質粒和陰性對照質粒后中MDM2-mRNA的表達的變化

2.3 siMDM2轉染后對細胞增殖的影響 MTT法結果表明轉染siMDM2后細胞的增殖速度和分裂指數都明顯降低;增殖抑制率隨時間的增加而增高:siMDM2-1和siMDM2-1組的增殖抑制率和空白對照組比差異具有顯著性,(P＜0.05);而且,24、48、72 h各時間組間的抑制率差異也有顯著性(P＜0.05)。

2.4 siMDM2轉染后對U251細胞凋亡的影響 轉染siMDM2-1,2后72 h,檢測細胞凋亡率分別為49.9%,40.0%,轉染陰性對照質粒組未見明顯凋亡。SiMDM2-1組和si MDM2-2組細胞處于S期的百分率分別為30.8%和 33.1%,明顯低于對照組(56.1%);而SiMDM2-1組和SiMDM2-2組細胞處于G0/G1期的百分率高于對照組。

圖3 siMDM2對細胞增殖的影響

3 討論

腦膠質細胞瘤是臨床上顱內腫瘤中最常見的一種。近年人們認識到膠質瘤的發生、發展是多個癌基因和抑癌基因異常改變的結果,與癌基因的激活、過表達或擴增,抑癌基因的缺失或突變失活密切相關。尤其是MDM2基因的擴增或過表達及p53基因突變在其中起著舉足輕重的作用。

抑癌基因p53誘導細胞凋亡和DNA修復,而MDM2能抑制p53的功能,并啟動p53泛素化和核輸出而誘導p53的降解[5]。研究表明,P53抑癌基因的失活及原癌基因MDM2的激活促使細胞異常增殖,從而導致腫瘤的發生[6]。p53基因突變失活是膠質瘤常見的遺傳學改變之一,MDM2在膠質瘤中的擴增與表達和腫瘤轉移、復發有關,在膠質瘤細胞發生和發展過程中發揮重要作用。Ichimura和Park[7,8]等曾報道在膠質母細胞瘤及間變性星形細胞瘤有MDM2基因過度表達。并在高度惡性的腫瘤細胞中發現有高水平的MDM2癌基因產物的表達;故認為MDM2與膠質瘤等腫瘤的發展和轉移有關。

SiRNA可以特異性地降解相應基因的mRNA,從而抑制該基因的表達。微量的siRNA即可使其編碼致病基因產物的含量明顯下降,達到剔除的效果;同時,siRNA的抑制作用具有嚴格的序列特異性,治療的針對性強,副作用小。因此,siRNA技術為腫瘤基因治療提供了一個新的可供選擇的策略和技術平臺。

本實驗我們設計合成了2對針對MDM2基因的干擾位點序列的siMDM2[3]。將構建的siMDM2真核表達質粒轉染至細胞后進行基因水平和凋亡的檢測。MDM2的2個干擾位點都具有強效的干擾效果。RT-PCR結果顯示siMDM2能有效地阻抑MDM2基因的表達,阻抑效應平均達到64.11%。MTT和流式細胞術檢測結果顯示:瞬時轉染siMDM2-1和siMDM2-2能有效抑制細胞增殖,使U251細胞增殖速度減慢,增殖抑制率與對照組比有顯著差異,并且隨著時間增殖抑制率有所增加。同時,發現si MDM2能誘導腫瘤細胞發生凋亡,而且使S期細胞減少,G0/G1期的細胞百分比增多,其細胞阻滯作用可能是其可以誘導細胞凋亡的原因之一。

本實驗繼呂佳音[9]等人對關于siMDM2對骨肉瘤的增殖影響的研究后進一步證明了siMDM2對膠質瘤細胞也同樣存在增殖抑制和誘導凋亡的作用。提示在膠質瘤治療中,以MDM2基因為靶點,利用siRNA技術進行基因治療有可能成為一種新的有效手段,本研究亦為后續的對其他腫瘤長效抑制的研究工作打下了堅實的基礎。

[1]Phan J,Li Z,Kasprzak A,et al.Structure-based design of high-affinity peptides inhibiting the interaction of p53 with MDM2 and MDMX[J].J Biol Chem,2009,12(12):1.

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[3]Khatri RG,Navaratne K,Weil RJ.et al.The role of a single nucleotide polymorphism of MDM2 in glioblastoma multiforme[J].J Neurosurg,2008,109(5):842.

[4]Elbashir SM,Harborth J,WeberK,et al.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs[J].Methods,2002,26(2):199.

[5]Yu S,Qin D,Shangary S,et al.Potent and Orally Active Small-Molecule Inhibitors of the MDM2-p53 Interaction[J].J Med Chem,2009,11(24):16.

[6]Lind H,Zienolddiny S,Ekstrom PO,Skaug Y,Haugen A.Association of a functional polymorphism in the promoter of the MDM2 gene with risk of nonsmall cell lung cancer[J].Int J Cancer,2006,2(22):24.

[7]Ichimura K,Bolin MB,Goike H M,et al.Deregulation of the p14ARF/MDM2/p53 pathway is a prerequisite for human astrocytic gliomas with G1-S transition control gene abnormalities[J].Cancer Res,2000,60(2):417.

[8]Park S,Hatanpaa KJ,Xie Y,et al.The receptor interacting protein 1 inhibits p53 induction through NF-kappaB activation and confers a worse prognosis in glioblastoma[J].Cancer Res,2009,1;69(7):2809.

[9]呂佳音,吳丹凱,趙燕穎,等.siRNA對骨肉瘤U2OS細胞株MDM2-mRNA表達的抑制作用[J].中國實驗診斷學,2007,11(7):878.