肺結核患者外周血CD4CDT細胞的臨床意義初探

張青 肖和平 粟波

(同濟大學附屬上海市肺科醫院同濟大學醫學院 上海 200433)

張青 肖和平 粟波

(同濟大學附屬上海市肺科醫院同濟大學醫學院 上海 200433)

目的通過測定肺結核患者外周血CD4CDT細胞的表達,探討CD4CDT細胞的的臨床意義>。方法2008年1月至2010年2月選取住院患者及門診做體檢的健康志愿者共78例,其中肺結核患者40例,門診健康志愿者38例,應用流式細胞技術測定外周血 T細胞表面分子CD4、CD8、CD4CD,以百分比表示表面分子陽性T細胞占淋巴細胞的比例>。結果外周血CD4CDT細胞,肺結核組(1.9%±1.3%)明顯高于健康組(0.7%±1.0%),差異有統計學意義(t=5.237,P＜0.01)。外周血CD4T細胞,肺結核組(47.9%±11.2%)低于健康組(56.0%±14.6%),差異有統計學意義(t=2.830,P＜0.01)。外周血CD8T細胞,肺結核組(26.2%±6.1%)低于健康組(33.0%±11.1%),差異無統計學意義(t=0.353,P＞0.05)。肺結核患者治療2月后,CD4CDT細胞(1.8%±0.8%)有下降,但與治療前比較差異無統計學意義(t=0.811,P＞0.05)。CD4T細胞、CD8T細胞均有升高(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%),但差異無統計學意義(t值分別為=1.496,0.570,均P＞0.05)>。結論CD4CDT細胞參與了肺結核患者的細胞免疫過程,發揮抑制CD4和CD8T細胞的活化與增殖的作用,從而影響了患者的臨床演變及預后。

結核,肺/血液;T淋巴細胞;流式細胞術

肺結核患者的臨床表現主要取決于宿主Th1/Th2免疫反應,T h1反應通過形成肉芽腫來遏制結核分枝桿菌生長[1],Th2反應不但無法遏制結核分枝桿菌,還會導致細菌播散,形成空洞,肺部組織毀損等重癥肺結核,患者不但臨床癥狀嚴重,影像學也往往表現為多個大小不一的空洞及肺組織的廣泛浸潤,使治療非常棘手。機體T細胞反應強度取決于宿主的免疫調節能力。近來,調節性 T細胞(T reg)逐漸被現代免疫學者所重視并研究[2-3],這類細胞可以抑制周邊效應 T細胞(Teff)的功能,并且主要通過釋放抑制性細胞因子(如白細胞介素-10,腫瘤生長因子-β)或通過細胞接觸機制加以實現[4]。雖然它的表型各家報道不一,但幾個研究都認為CD4CD是調節性T細胞較明確的表型[5-7]。同時,調節性T細胞也表達特有的趨化因子,可誘導其自身遷徙至病灶部位,下調效應 T細胞的功能。因此,調節性T細胞參與了結核分枝桿菌胞內感染的免疫防御過程,但是它在肺結核患者中的變化還不清楚。

1 資料和方法

1.1 研究對象 受試者為2008年1月至2010年2月住院的肺結核患者及門診體檢志愿者共78例,其中男59例,女 29例,年齡18～71歲,平均(40±13)歲,體質量指數＞18.5 kg/m2。

1.1.1 分組 (1)初治肺結核患者(簡稱“肺結核組”)40例,共篩選符合診斷標準的肺結核患者42例,1例痰分枝桿菌藥敏結果為耐多藥肺結核,1例合并干燥綜合征,故被排除。余40例用于本研究,其中男28例,女12例,平均年齡(41±15)歲。(2)同期選取在門診做體檢的健康志愿者38例(簡稱健康組),共篩選了40例,1例PPD陽性,1例血糖升高,均被排除,余 38例用于本研究,其中男21例,女17例,平均年齡(40±11)歲。他們的X線胸片未見異常,否認有結核病史,無嚴重心、肝、腎、過敏性疾病史及其他超敏反應性疾病史,未服用過任何糖皮質激素及其他免疫抑制劑。

1.1.2 診斷標準 初治肺結核的診斷參照《臨床診療手冊·結核病分冊》[8],并且痰分枝桿菌涂片檢查至少2次陽性。結核分枝桿菌素試驗采用5個國際單位結核分枝桿菌純蛋白衍生物[9],硬結＜5 mm判斷為陰性。

1.1.3 排除標準 合并免疫系統相關疾病、腫瘤的患者;痰分枝桿菌培養結果為非結核分枝桿菌生長的患者;藥物敏感試驗提示為耐多藥結核病患者;HIV陽性患者;PPD陽性的健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 CD4-ECD、CD8-ECD、CD25-FITC單克隆抗體,試劑生產商為Beckman Coulter Immuntech SAS(13276 Marseille Cedex 9,France),以及Beckman Coulter Cytomics FC500流式細胞儀(Beckman Coulter公司,美國)。

1.2.2 試驗方法 40例肺結核患者簽署知情同意書,在抗結核治療前及治療后2月用流式細胞儀測定外周血CD4、CD8、CD4CDT細胞的表達率。健康者僅測定 1次外周血CD4、CD8、CD4CDT細胞。采用肝素抗凝全血進行熒光標記,100 μ L全血分別先后加入CD4-ECD、CD8-ECD、CD25-FITC抗體室溫下孵育30 min,加0.5 ml OptiLyse C溶血素(Coulter公司,法國)溶血,2 000 rpm 離心,加0.5 ml PBS洗滌重懸細胞待流式細胞儀分析。流式分析方案：在FS-SS雙參數圖上設門選定淋巴細胞群,在CD4-CD25雙參數圖上檢測雙陽性細胞。CD25高表達的細胞群設定為CD,見圖1。采集軟件用 CXP Cytometer,分析軟件用CXP Analysis。

1.2.3 質量控制 質控管內加入同型對照抗體IgG-ECD/IgG-FITC。

1.3 統計學處理 數據結果采用x ±s描述。用SPSS13.0統計軟件進行分析,2組間均值的比較用Student's t檢驗,配對資料用配對t檢驗,構成比采用Person χ2檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 CD4-CD25雙參數圖

2 結果

2.1 一般情況 2組受試者的一般情況見表1。年齡、性別構成比及身高體質量指數(BMI)在2組間差異無統計學意義(均P＞0.05),具有可比性。

表1 2組受試者的一般情況

2.3 治療前后T細胞亞群表達率的比較 40例肺結核患者治療 2月后復查外周血 CD4、CD8、CD4CDT細胞,與治療前比較的結果見表3。治療2月后CD4CDT細胞(1.8%±0.8%)有下降,但與治療前比較差異無統計學意義(t=0.811,P＞0.05)。CD4T細胞、CD8T細胞均有升高(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%),但差異無統計學意義(t值分別為=1.496,0.570,均P＞0.05)。

表2 2組受試者T細胞亞群表達率的比較(%)

表3 肺結核患者治療前后T細胞亞群表達率的比較(%)

3 討論

Th1型免疫反應是控制結核分枝桿菌生長所必須的基本條件[10],效應T細胞在化學因子及其他趨化分子的驅動下做選擇性遷徙,干預疾病的細胞免疫類型和強弱程度,使結核患者的免疫病理、臨床表現各不相同。Walrath J等[11]的研究表明,T h1、Th2型免疫反應直接影響疾病的臨床嚴重程度,比如可表現為局限或是播散或形成空洞。Th1、Th2型效應細胞在體內的選擇性遷徙成為局部免疫的關鍵。但是,肺結核病人的免疫調節機制除了上述重要因素外,還存在其他疑點,尚未得到最終結論。

近10年來先后發現了很多不同來源的T細胞,其中針對效應T細胞發生作用的一類特殊T細胞亞群即調節性T細胞逐漸引起了研究者的關注。這類細胞即可通過抑制免疫反應緩解疾病,如自身免疫疾病和移植排斥[12],也可加速病理條件惡化,阻礙免疫反應,削弱宿主對病理過程的控制能力,如腫瘤和黑熱病[13]。本研究的結果提示肺結核患者外周血CD4CDhigh25T細胞含量明顯高于健康人,說明肺結核病人存在著由調節性T細胞所致的免疫抑制。我們推測肺結核患者外周血中的調節性T細胞不僅存在于血液循環系統,還有很大一部分遷移至病灶部位,因為CD4CD25+T細胞在炎癥因子和淋巴因子作用下特異性表達趨化因子受體CCR4和CCR8,與樹突狀細胞及吞噬細胞分泌的CCL17和CCL22趨化因子結合,引導CD4CD25+T細胞向炎癥部位和次級淋巴組織遷徙來阻止CD4CD25-T細胞的活化[14]。盡管效應T細胞也在化學因子的作用下遷徙到病灶部位,但由于調節性T細胞可以發揮更強的抑制作用,使效應T細胞不足以提供有效的免疫保護,進而Th1型效應T細胞被抑制,機體失去了阻止疾病惡化的能力。體外試驗結果表明,將CD4CDhigh25T細胞從活動性結核病患者外周血中剝奪后,再用分枝桿菌抗原刺激,外周血細胞分泌更多的干擾素-γ,而結核潛伏感染和健康人無此現象[15],說明CD4CDT細胞只在結核病活動期下調T細胞反應。因此,結核病人的細胞免疫與CD4CDT細胞密切相關。

本文的結果還提示,肺結核患者與健康對照者比較,外周血的CD4CD調節性T細胞明顯升高,而CD4T細胞數量明顯減低,CD8T細胞數量也略低,在抗結核治療2月后,上述指標均有所恢復,說明CD4CDT細胞發揮了抑制CD4和CD8T細胞的活化與增殖的作用,與某些報道一致[7,16]。但因本研究治療的時間較短,所觀察的指標在治療前后的差異尚無統計學意義,隨著治療的不斷延續,肺結核患者的免疫抑制將逐漸改善。本研究之所以測定以CD4CD為表型的調節性T細胞,是為了使其具有更好的同源性。早期的某些研究都用CD4CD25雙陽性來代表調節性T細胞,但引發了很多人的質疑,因為有些活化的T細胞表面也同樣表達CD25,所以單純CD4CD25+不能反映調節性T細胞的真正含量。

本研究的不足之處在于未能進行CD4CD25+T細胞的轉錄因子FOXP3或其mRNA的檢測,因此無法深入了解CD4CD25+T細胞的細胞水平及功能活性。

由上提示Treg參與了肺結核患者的細胞免疫過程,與Teff同樣發揮著重要作用,可以推動免疫向促炎方向發展,或是向免疫抑制方向發展,從而影響了肺結核患者的臨床演變及預后。

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Clinical significance of CD4CDT cells in patients with pulmonary tuberculosis

Zhang Qing,Xiao Heping,Su Bo
Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University,Tongji University School of Medicine,Shanghai200433,China

ObjectiveTo observe the clinical significance of CD4CDhigh25T cells from peripheral blood in pulmonary tuberculosis(PTB)patients.MethodsFrom January 2008 to February 2010,40 hospitalized PTB patients and 38 healthy controls from outpatient department for physical examination were enrolled.CD4,CD8 and CD4CDT cells which were presented by their percentages in peripheral blood lymphocytes of the above subjects were assessed by flow cytometry.ResultsThe frequencies of CD4CDT cells in PTB patients(1.9%±1.3%)were significantly higher than that in healthy controls(0.7%±1.0%)(t=5.237,P＜0.01).The frequencies of CD4T cells in PTB patients(47.9%±11.2%)were significantly lower than that in healthy controls(56.0%±14.6%)(t=2.830,P＜0.01).The frequencies of CD8T cells in PTB patients(26.2%±6.1%)were somewhat lower than that in healthy controls(33.0%±11.1%),but there was not statistical difference(t=0.353,P＞0.05).After 2 months of anti-TB treatment,the frequencies of CD4CDT cells in PTB patients(1.8%±0.8%)were decreased as compared with pre-treatment but without statistic significance(t=0.811,P＞0.05),while the frequencies of CD4T cells and CD8T cells in PTB patients(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%)were all increased as compared with pre-treatment but without statistic significance(t=1.496,0.570,respectively,all P＞0.05).ConclusionsCD4CDT cells are involved in cellular immune of PTB patients,inhibiting the activation and proliferation of CD4 and CD8T cells,affecting the clinical manifestations and prognosis of PTB.

tuberculosis,pulmonary/blood;T-lymphocytes;flow cytometry

Zhang Qing(zhqi709851@sohu.com)

張青(zhqi709851@sohu.com)

2010-07-11)

(本文編輯：張曉進)