七氟烷后處理對大鼠缺血/再灌注損傷心功能和ERK1/2表達的影響

陳洪濤，雷春亮，李寶金，楊承祥，李 恒

(1.廣州市第八人民醫院，廣東廣州 510060;2.佛山市第一人民醫院，廣東佛山 528000)

細胞外信號調節激酶(ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶超家族成員，在介導細胞分化、增殖、存活中起重要作用，可被多種信號激活［1］。在對再灌注損傷心肌保護機制的研究中，ERK1/2的激活可能起著重要的作用。揮發性麻醉藥后處理是近年來提出的一種對減輕再灌注損傷具有較大臨床意義的新方法［2］。研究表明，同缺血預處理［3］、藥物預處理［4］以及前幾年提出的缺血后處理［5］一樣，七氟烷等吸入麻醉藥能模擬缺血后處理，對再灌注損傷心肌具有保護作用［6］。七氟烷是一種麻醉性能優越，目前被認為接近“理想”的新型吸入麻醉藥，人們對其后處理心肌保護機制的研究尚處于初級階段。本實驗旨在研究七氟烷對缺血/再灌注心肌細胞ERK1/2活性的影響，探討其心肌保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑七氟烷(sevoflurane，批號7129，丸石制藥株式會社);2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC;Sigma，USA);PD98059(Sigma，USA);DMSO(衢州市瑞爾豐化工有限公司，批號20100210);Western細胞裂解液、SDS/PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS/PAGE凝膠配制試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(江蘇海門市碧云天生物技術研究所);鼠單克隆抗磷酸化 ERK1/2［Phospho-p44/42 MAP Kinase(Thr202/Tyr204)(E10)Mouse mAb］和總的ERK1/2［p44/42 MAP Kinase(L34F12)Mouse mAb］抗體、兔多克隆抗磷酸化p70S6K〔Phospho-p70S6 Kinase(Thr421/Ser424)Antibody〕和總的 p70S6K(p70S6 Kinase Antibody)抗體(Cell Signalling Technology，USA);堿磷酶標記抗小鼠、堿磷酶標記抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。PD98059按說明書要求溶于DMSO(6.5 g·L-1)。

1.2動物選擇與分組SPF級SD♂大鼠，體質量250～300 g［中山大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SYXK(粵)2007-0081］。(1)評估七氟烷后處理的心肌保護作用:64只SD♂大鼠隨機分為8組(n=8):假手術組(Sham)，缺血/再灌注組(Control)，后處理組(Post，Sevo，DMSO，PD98059，Post+PD，Sevo+PD)。(2)p-ERK1/2活性的測定:組別同上(n=6)，各組復灌15 min時取下心臟迅速液氮凍存。

1.3Langendorff心臟灌注模型的制備模型的制備同我們先前的研究［7］:大鼠腹腔注射500 U·kg-1肝素抗凝和40 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉，迅速開胸取心臟置于0℃的K-H液中，動脈插管，置于Langendorff灌注裝置上，以95%的O2和5%CO2飽和K-H液逆行灌注，溫度37℃ ，灌注壓10.4 kPa，pH(7.38 ±0.05)，K-H 液成分(mmol·L-1):NaCl 118，MgSO41.2，KCl 4.7，KH2PO41.2，NaHCO325，CaCl22.5，葡萄糖 11.1，EDTA-Na20.125。左室插管接壓力換能器(Maclab/4S)，經Maclab/4S模擬換轉器(AD.2 Struments公司，澳大利亞)與machosh7200/90型計算機(Apple公司，美國)連接，連續監測心功能指標。Sham組持續灌注150 min;Control組平衡灌注30 min，缺血30 min，再灌注90 min;Post組在缺血/再灌注即刻進行4個循環復灌25 s/缺血25 s，然后再灌注至150 min;Sevo組缺血復灌時給予含3.0V/V飽和七氟烷的K-H液灌注5 min，沖洗10 min，再灌注至150 min;DMSO和PD98059組復灌時分別給予含DMSO(＜0.2%)、PD98059(20 μmol·L-1)的K-H液灌注15 min;Post+PD組復灌時缺血后處理的同時給予15 min的PD98059(20 μmol·L-1);Sevo+PD組復灌時七氟烷后處理的同時給予15 min 的 PD98059(20 μmol·L-1)。

1.4功能學指標的監測左心耳處剪開一個小口，將帶有小乳膠水囊的測壓管經二尖瓣口插入左心室，連接壓力換能器，通過連接于三通上的含水注射器，調節左心室內水囊的容量使左心室舒張末壓(LVEDP)為0.5～0.8 kPa。持續監測左心室功能指標:左室舒張末期壓 LVEDP、左心室發展壓(LVDP)、左心室上升最大速率(+dp/dt)、左心室下降最大速率(-dp/dt)、心率(HR)。

1.5冠狀動脈流量測定在肺動脈圓錐處剪一小口，使冠狀動脈液自然流出，分別在平衡灌注末，再灌注30、60、90 min用量筒收集冠狀動脈流出液并測量其體積，單位以ml·min-1表示。

1.6梗死面積的測定用TTC染色法測定再灌注90 min后的心肌梗死面積。從-80℃冰箱中取出心臟，由心尖部向心底部取心室部分橫向切成1 mm厚度薄片若干，放入1%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，37℃水浴孵育20 min，染色過程中不時振蕩染色液使之與心肌充分接觸，存活心肌呈磚紅色，梗死區不著色呈灰白色，把心肌片用雙蒸水沖去多余的染料，并排置于濾紙上吸干水分，放在玻片上，用Image master圖像分析儀(Pharmacia Bioten公司，美國)分析梗死心肌面積占心肌總面積的百分比(梗死心肌面積/總心肌面積×100%)。

1.7Western blot法半定量測定p-ERK、pp70S6K取液氮凍存心肌的心室部分，Western細胞裂解液按說明書要求勻漿，勻漿液4℃ 14 000×g離心15 min，以 BSA 為標準，Bradford法［8］測定上清液蛋白濃度。按照每4 μl蛋白樣品加入1 μl SDS/PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)比例混合，沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。取等量40 μg樣本載到SDS/PAGE凝膠上電泳，電轉膜至硝酸纖維膜，Western封閉液封閉6 h，一抗4℃孵育24 h，二抗室溫緩慢振蕩孵育2 h，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。Image J軟件進行灰度分析。

1.8統計學處理數據均以±s表示，應用SPSS 13.00統計學分析軟件，組內比較用配對t檢驗，同一時間、不同組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性用Least significant difference(最小顯著差法)檢驗。

2 結果

2.1功能指標Tab 1顯示各組平衡灌注末心功能指標組間差異無統計學意義(P＞0.05)，再灌注30、60、90 min，除Sham組外，其余各組心功能指標明顯低于基礎值(P＜0.05)，同Sham組比，其余各組其余各組心功能指標明顯下降(P＜0.05)，同Control組比，Sevo組和Post組的心功能指標明顯上升(P＜0.05)，Sevo組和 Post組比較差異無統計學意義。見Tab 1。

2.2對梗死面積的影響Tab 2顯示復灌90 min后，Control組的梗死面積為41.7% ±5.1%，Sevo組和Post組的梗死面積分別為24.1%±3.5%和22.7% ±3.2%(P＜0.05)，Sevo組和Post組比較差異無統計學意義。見Fig 1，Tab 2。

2.3對胞質中p-ERK1/2、p-p70S6K蛋白的影響Western blot分析，Control組的 p-ERK、p-p70S6K表達高于Sham組(P＜0.05);Sevo組和Post組的p-ERK、p-p70S6K表達進一步高于Control組(P＜0.05);Sevo組和Post組的p-ERK、p-p70S6K表達差異無統計學意義。見Fig 2 A，B。

3 討論

本實驗證實七氟烷后處理提高了復灌后期離體大鼠左心室的+dp/dt、-dp/dt、LVDP，降低了左心室的LVEDP，表明七氟烷后處理可以改善缺血/再灌心肌的收縮和舒張功能。復灌末心肌梗死面積的明顯減少，說明七氟烷后處理可以減輕心肌的缺血/再灌注損傷，具有明顯的心肌保護作用。

Tab 1 Hemodynamics(±s，n=8)

Tab 1 Hemodynamics(±s，n=8)

*P＜0.05 vs baseline(intragroup comparison);#P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs control(intergroup comparison).R:reperfusion;Sham:Timematched perfusion;Control:Unprotected hearts exposed to ischemia-reperfusion;Post:Ischemia postconditioning;Sevo:Sevoflanrane postconditioning;DMSO:Dimethyl sulfoxide;PD=PD98059;LVEDP:Left ventricular end-diastolic pressure;LVDP:Left ventricular developed;+dp/dt:Inotropy;-dp/dt:Lusitropy;HR:Heart rate;CF:Coronary flow

Group Baseline R 30 min R 60 min R 90 min LVEDP/kPa Sham 0.71±0.08 0.76±0.08 0.78±0.12 0.97±0.11 Control 0.68±0.09 4.48±0.94*# 4.53±0.94*# 4.69±0.97*#Post 0.66±0.09 2.59±0.63*#△ 2.63±0.63*#△ 2.71±0.65*#△Sevo 0.70±0.08 2.67±0.69*#△ 2.73±0.72*#△ 2.81±0.70*#△DMSO 0.61±0.08 4.22±0.90*# 4.28±0.88*# 4.50±0.92*#PD 0.72±0.09 4.55±0.94*# 4.62±0.97*# 4.87±0.98*#Post+PD 0.65±0.08 4.04±0.85*# 4.20±0.86*# 4.30±0.89*#Sevo+PD 0.63±0.07 3.92±0.89*# 4.02±0.88*# 4.22±0.86*#LVDP/kPa Sham 16.8±1.5 16.1±1.6 15.8±1.7 15.3±1.6 Control 16.2±1.1 9.6±1.3*# 9.3±1.5*# 8.6±1.2*#Post 15.8±1.3 12.2±1.5*#△ 11.2±1.3*#△ 11.0±1.6*#△Sevo 16.0±1.3 11.8±1.2*#△ 11.7±1.3*#△ 11.2±1.5*#△DMSO 15.8±1.5 9.6±1.3*# 9.2±1.2*# 8.5±1.5*#PD 15.7±1.3 9.3±1.6*# 8.8±1.5*# 8.1±1.3*#Post+PD 16.4±0.9 10.0±1.6*# 9.6±1.7*# 9.7±1.5*#Sevo+PD 16.1±1.2 9.6±1.5*# 9.4±1.6*# 9.0±1.3*#+dp/dt/kPa·s-1 Sham 463±31 462±32 459±34 455±37 Control 459±48 230±41*# 224±38*# 218±36*#Post 452±41 337±43*#△ 334±42*#△ 329±46*#△Sevo 454±33 335±26*#△ 332±27*#△ 327±30*#△DMSO 453±34 227±29*# 219±29*# 215±26*#PD 450±36 225±34*# 217±33*# 212±31*#Post+PD 457±44 238±43*# 237±42*# 234±41*#Sevo+PD 455±37 235±32*# 232±30*# 227±29*#-dp/dt/kPa·s-1 Sham 345±30 344±30 341±31 334±32 Control 343±44 164±30*# 169±30*# 163±32*#Post 332±38 242±36*#△ 240±35*#△ 233±36*#△Sevo 336±28 240±23*#△ 234±24*#△ 229±26*#△DMSO 339±30 167±29*# 162±29*# 158±30*#PD 333±33 159±28*# 158±30*# 152±28*#Post+PD 341±43 175±36*# 172±36*# 168±35*#Sevo+PD 340±33 172±29*# 165±28*# 160±30*#CF/ml·min-1 Sham 14.1±0.8 13.9±0.7 13.8±0.8 13.4±0.9 Control 13.9±1.1 7.8±0.7*# 7.6±0.6*# 7.2±0.6*#Post 13.6±1.2 10.6±0.9*#△ 10.3±1.0*#△ 10.0±1.1*#△Sevo 13.9±0.8 10.9±0.6*#△ 10.8±0.6*#△ 10.5±0.7*#△DMSO 13.8±1.0 7.6±0.8*# 7.3±0.5*# 7.0±0.7*#PD 13.6±0.9 7.4±1.2*# 7.2±1.3*# 7.0±1.2*#Post+PD 13.9±1.1 7.9±1.0*# 7.8±1.1*# 7.6±0.9*#Sevo+PD 13.8±0.9 8.1±1.0*# 7.7±1.3*# 7.3±0.9*#HR/beats·min-1 Sham 306±15 304±14 301±15 297±17 Control 304±13 250±23*# 247±21*# 245±18*#Post 296±10 263±21*# 260±19*# 258±19*#Sevo 303±12 261±16*# 257±15*# 256±10*#DMSO 301±17 249±18*# 245±16*# 241±15*#PD 298±13 246±25*# 243±21*# 239±18*#Post+PD 303±15 254±16*# 252±15*# 248±14*#Sevo+PD 302±11 252±14*# 249±10*# 246±11*#

Fig 1Tab 2 infarct size of each group(%，±s，n=6)

Tab 2 The percentage of infarct size of myocardium at the end of reperfusion(±s，%)

Tab 2 The percentage of infarct size of myocardium at the end of reperfusion(±s，%)

Infarct size was determined using 1%triphenyltetrazolium chloride staining，as described in the methods section.In each group，six hearts were used，*P＜0.05 vs control

40.3±4.2 42.8±5.3 39.5±4.6 38.4±5.4 Control Post Sevo DMSO PD Post+PD Sevo+PD 41.7±5.1 22.7±3.2* 24.1±3.5*

Fig 2 Western blot analysis(ˉx ± s)

七氟烷后處理可能同其他鹵類吸入麻醉藥一樣通過抑制缺血/再灌注心肌早期的異常活動，以及激活某些信號通路，減輕調理介質的失調產生心肌保護作用。

本實驗發現七氟烷后處理可以誘導ERK1/2的活性升高，ERK1/2的抑制劑 PD98059抑制了ERK1/2的活性，同時抵消了七氟烷后處理的心肌保護效果，證實ERK傳導通路在七氟烷后處理的心肌保護中發揮著重要的作用。在對心肌保護機制的研究中，ERK和PI3K被視為心肌保護補救激酶途徑得到了廣泛的研究。巧合的是，預處理和后處理保護機制中都包含了這兩種蛋白激酶的信號傳導通路，看起來這兩種心肌保護方法在心肌缺血/再灌時可能共享了某種信號通路，這條通路也可能就是各種心肌保護方法潛在的共用靶點，然而，在利用不同的模型對不同種屬動物的研究中，ERK和PI3K介導心肌保護的作用仍備受爭議。

ERK在1990年首次被描述為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，即被各種胞外信號包括胰島素和神經生長因子磷酸化的酪氨酸［9］。大多數的研究證明ERK1/2是預處理和后處理產生心肌保護作用重要的信號通路，但仍存在爭議。Krolikowski實驗組利用在體兔缺血/再灌模型，用1.0 MAC異氟烷后處理研究發現，在第1個15 min的再灌注期間，利用PD98059抑制ERK1/2或者利用LY-294002抑制PI3K，都會使異氟烷后處理的心肌保護作用喪失，認為這兩條通路在異氟烷后處理的心肌保護作用中都起著重要的作用［10-11］。Darling 等［12］利用離體兔的缺血/再灌注模型證實缺血后處理的心肌保護作用依賴 ERK傳導通路的激活而非 PI3K，而 Zhu等［13］利用在體鼠缺血后處理模型，認為缺血后處理的心肌保護作用是通過PI3K傳導通路而不依賴ERK。還有一些學者認為［14-16］這兩條傳導通路都介導了預處理和后處理的心肌保護，以上研究結果的異同可能與采用的實驗條件和動物模型不同有關。目前尚未見七氟烷后處理心肌保護機制關于ERK1/2信號通路研究的文獻報道，本實驗對大鼠離體心臟灌注模型用3.0%七氟烷后處理，發現缺血/再灌注15 min后ERK1/2的活性增加，七氟烷誘導ERK1/2的活性進一步加強，ERK1/2的抑制劑PD98059抵消了七氟烷誘導的心肌保護效果，證實ERK1/2是七氟烷后處理誘導心肌保護一條重要的信號通路。ERK是多條信號通路的關鍵環節，一些研究還顯示在心肌肥大、持續性心律失常等病理生理過程中，可能通過激活ERK等信號通路參與心肌結構的重塑過程［17-18］。本實驗盡管顯示 ERK1/2在心肌保護中起著重要的作用，但其介導心肌保護的具體機制目前仍不清楚，七氟烷和異氟烷具有相似的藥理特性，它們誘導的心肌保護機制應具有相似的信號通路，這需要進一步的研究證實。

p70S6K是ERK1/2的下游靶點，對細胞的生長和存活起著關鍵性的作用。p70S6K可以通過調節促凋亡蛋白BAD的活性抗細胞凋亡來介導心肌保護［19］。本實驗發現，ERK1/2的下游靶點 p70S6K的活性隨著ERK1/2活性的增加而增加，ERK1/2的抑制劑也可部分抑制p70S6K的活性，揭示七氟烷后處理可能通過激活ERK1/2/p70S6K這條抗細胞凋亡信號通路來介導心肌保護。但本實驗只能說明七氟烷后處理可以提高p70S6K的活性，其心肌保護作用是否通過這條通路尚需進一步證實，而且通過兩條條帶對比發現，盡管PD98059完全抑制了ERK1/2的活性，p70S6K的活性卻并沒被完全抑制，說明p70S6K的活化可能還存在其他的通路調節。

我們還發現，復灌15 min時，同假手術組比，缺血/再灌注心肌細胞p-ERK1/2的表達增加，說明缺血/再灌注損傷可使組織細胞的ERK1/2迅速激活，ERK1/2可能作為早期細胞內信號參與了細胞對這一應激反應的調節，因此缺血/再灌注時ERK1/2活性的增加可能是細胞缺血/再灌注損傷的修復過程，是細胞存活的保護性機制，對于經歷了缺血/再灌注損傷的心肌具有保護作用，七氟烷通過進一步增強ERK1/2活性加強了這種保護效果。同時，條帶還顯示缺血后處理同七氟烷后處理一樣使ERK1/2和p70S6K的活性進一步加強，ERK1/2的抑制劑PD98059抑制了ERK1/2的活性，同時抵消了缺血后處理的心肌保護效果，證實ERK傳導通路在缺血后處理的心肌保護中也發揮著重要的作用。揭示兩者可能存在相似的心肌保護機制，ERK1/2可能是這兩種保護途徑的共同靶點。

本實驗也發現七氟烷能明顯提高再灌期心肌的冠狀動脈血流量，對改善再灌期無復流現象起到積極作用，這和我們先前的研究結果一致［7］。心肌無復流現象是缺血/再灌注損傷的一個重要特征，再灌期缺血區微血管堵塞得不到充分的灌注，冠狀動脈血流量下降，冠狀動脈血流量的改變可影響再灌注損傷的發展，冠狀動脈擴張劑能提高缺血/再灌心肌的功能［20］。鑒于揮發性麻醉藥具有降低冠狀動脈阻力，明顯增加冠狀動脈血流量的藥理特性，許多研究認為揮發性麻醉藥的心肌保護作用與其增加心肌冠狀動脈血流量有關［21］。七氟烷可擴張冠狀動脈，冠狀動脈竊血的危險性明顯小于異氟烷，吸入高濃度七氟烷不減少冠狀動脈血流量，Kehl等［22］證實1.5MAC七氟烷并未引起犬冠狀動脈血流的異常分布，即所謂的“冠脈竊血”，而是優先增加了冠狀動脈側支血管的血流量，Ca2+激活K+通道是其機制之一。Harkin等［23］認為七氟烷對冠狀動脈血管的擴張作用不同于氟烷與異氟烷，七氟烷不影響舒張期冠狀動脈流速。本實驗只是對復灌30 min后的冠狀動脈血流量進行了統計，并沒做這方面更早期的研究，但發現信號通路ERK的抑制劑PD98059不僅抵消七氟烷的心肌保護效果，而且也阻斷了七氟烷提高冠狀動脈血流量的能力，說明再灌注早期的冠狀動脈血流量的恢復可能與七氟烷的藥理特性有關，而后期的冠狀動脈血流量的增加可能只是與其能減輕心肌細胞血管內皮細胞腫脹、改善心肌微循環這種間接的心肌保護作用有關。

3.0 %的七氟烷后處理可誘導ERK1/2的活性增加，改善缺血/再灌心肌的收縮和舒張功能，減少心肌梗死面積，具有明顯的心肌保護作用。近年來，隨著器官移植、體外循環下心臟外科手術的廣泛開展，缺血/再灌注損傷已成為臨床麻醉面臨的一種常見的病理生理變化。七氟烷等吸入麻醉藥對缺血/再灌注損傷心肌保護的內在機制是復雜的、多重的，仍需大量的動物實驗和臨床試驗進一步探索。

［1］Fukunaga K，Miyamoto E.Role of MAP kinase in neurons［J］.Mol Neurobiol，1998，16(1):79-95.

［2］陳洪濤，楊承祥.揮發性麻醉藥后處理-心肌保護的新策略［J］.心血管學進展，2008，29(3):487-90.

［2］Chen H T，Yang C X.Volatile anesthetics postconditioning:A new cardioprotective strategy［J］.Adv Cardiovasc Dis，2008，29(3):487-90.

［3］李淑娟，吳艷娜，康 毅，等.無創性肢體缺血預適應對大鼠心肌缺血/再灌損傷后心肌凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(1):100-4.

［3］Li S J，Wu Y N，Kang Y，et al.Effects of limb atraumatic ischemic preconditioning on apoptosis induced by myocardial ischemiareperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):100-4.

［4］曹澤玲，楊庭樹，龍超良，等.心肌缺血/再灌注損傷的內源性保護機制研究進展［J］.中國藥理學通報，2006，22(8):912-6.

［4］Cao Z L，Yang T S，Long C L，et al.Advances in study of endogenous protective mechanisms of cardiac ischemia/reperfusion injuries［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(8):912-6.

［5］徐 鋼，季 永，汪 莉，等.內源性硫化氫參與缺血后處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷［J］.中國藥理學通報，2008，24(7):910-4.

［5］Xu G，Ji Y，Wang L，et al.Endogenous hydrogen sulfide participating in the ischemic postconditioning against cardiac ischemic/reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):910-4.

［6］Chen H T，Yang C X，Li H，et al.Cardioprotection of sevoflurane postconditioning by activating extracellular signal-regulated kinase 1/2 in isolated rat hearts［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29(8):931-41.

［7］陳洪濤，楊承祥，李 恒，等.七氟烷后處理對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷心功能和線粒體的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(6):766-71.

［7］Chen H T，Yang C X，Li H，et al.Effects of sevoflurance postconditioning on cardial function and mitochondrial of isolated rat heart with acute myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):766-71.

［8］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(3):248-54.

［9］Boulton T G，Yancopoulos G D，Gregory J S，et al.An insulin-stimulated protein kinase Similar to yeast kinases involved in cell cycle control［J］.Science，1990，249(6):64-7.

［10］Krolikowski J G，Weihrauch D，Bienengraeber M，et al.Role of Erk1/2，p70s6K，and eNOS in isoflurane-induced cardioprotection during early reperfusionin vivo［J］.Can J Anaesth，2006，53(2):174-82.

［11］Chiari P C，Bienengraeber M W，Pagel P S，et al.Isoflurane protects against myocardial infarction during early reperfusion by activation of phosphatidylinositol-3-kinase signal transduction:evidence for anesthetic-induced postconditioning in rabbits［J］.Anesthesiology，2005，102(2):102-9.

［12］Darling C E，Jiang R，Maynard M，et al.Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts:role of ERK1/2［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(4):H1618-26.

［13］Zhu M，Feng J，Lucchinetti E，et al.Ischemic postconditioning protects remodeled myocardium via the PI3K-PKB/Akt reperfusion injury salvage kinase pathway［J］.Cardiovasc Res，2006，72(1):152-62.

［14］Hausenloy D J，Tsang A，Mocanu M M，et al.Ischemic preconditioning protects by activating prosurvival kinases at reperfusion［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288(2):H971-6.

［15］Yang X M，Proctor J B，Cui L，et al.Multiple，brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways［J］.J Am Coll Cardiol，2004，44(5):1103-10.

［16］Tsang A，Hausenloy D J，Mocanu M M，et al.Postconditioning:a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway［J］.Circ Res，2004，95(3):230-2.

［17］江鳳林，馮 俊，鄭 智.丹參酮ⅡA磺酸鈉對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應中磷酸化細胞外信號調節激酶1/2的作用［J］.中國藥理學通報，2008，24(3):307-12.

［17］Jiang F L，Feng J，Zheng Z.Effect of sodium tanshinoneⅡA sulfonate on activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 in angiotensin Ⅱ-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):307-12.

［18］胥雪蓮，覃 數，雷 寒，等.辛伐他汀改善大鼠心肌梗死后心室重塑與p-ERK1/2的關系［J］.中國藥理學通報，2002，24(2):258-61.

［18］Xue X L，Qin S，Lei H，et al.Simvastatin ameliorates rat ventricular remodeling after myocardial infarction:the role of phosphorylating extracellular signal-regulated kinase 1/2［J］.Chin Pharmacol Bull，2002，24(2):258-61.

［19］Harada H，Andersen J S，Mann M，et al.p70S6 kinase signals cell survival as well as growth，inactivating the pro-apoptotic molecule BAD［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(17):9666-70.

［20］Sizova E N，Tsirkin V I，Dvorianskiǐ S A.The role of endogenous modulators of chemoreactivity in the regulation of coronary blood flow［J］.Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova，2002，88(7):856-64.

［21］Li H，Wang J K，Zeng Y M，et al.Sevoflurane post-conditioning protects against myocardial reperfusion injury by activation of phosphatidylinositol-3-kinase signal transduction［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(9):1043-51.

［22］Kehl F，Krolikowski J G，Tessmer J P，et al.Increases in coronary collateral blood flow produced by sevoflurane are mediated by calcium-activated potassium(BKCa)channelsin vivo［J］.Anesthesiology，2002，97(3):725-31.

［23］Harkin C P，Pagel P S，Kersten J R，et al.Direct negative inotropic and lusitropic effects of Sevoflurane［J］.Anesthesiology，1994，81(1):156-67.