巴戟天糖鏈對缺氧復氧損傷內皮細胞的血管形成作用研究

王 寧，周 鵬，2，馮國清，劉心玉，張培君，吳 斌，胡香杰，喬 鵬

(1.鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室，河南鄭州 450052;2.河南中醫學院一附院，河南鄭州 450001)

巴戟天(radix morinda officinalis，RMO)為茜草科植物，肉質根入藥，是我國著名的四大南藥之一，具有傳統的補腎壯陽、強筋骨，祛風濕等作用。巴戟天糖鏈(morindae officinalis oligosaccharides，MOO)是巴戟天醇提物的主要有效成分，本課題組既往研究表明，MOO具有明顯的減輕缺氧/復氧或缺血/再灌注對心肌的損傷［1］。可以促進雞胚絨毛尿囊血管生成［2］;增加MVD的數量，而且上調與血管新生相關的VEGF、bFGF蛋白的表達，具有促進缺血心肌血管新生的作用［3］。本實驗選擇HUVEC為研究對象，首次從細胞水平觀察MOO對缺氧損傷內皮細胞遷移及管腔樣結構形成的影響，旨在進一步觀察MOO促血管生成效應，并為其在缺血心肌保護及促進缺血心臟建立側枝循環方面的作用提供更加直觀的實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細胞 人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)鄭州大學生物系多肽生化實驗室祁元明老師惠贈。

1.1.2主要藥品及試劑 巴戟天糖鏈(Morinda officinalis oligosaccharides)的制備:巴戟天(購自廣東省德慶縣藥材公司，一等品，河南省藥品檢驗所李杰鑒定)生藥15 kg粉碎后，分次用體積分數為0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，將乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得濃縮液。用適量的蒸餾水稀釋后，分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，棄去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用層析柱方法分離收集糖鏈部分，其純度為98.76%。實驗用蒸餾水稀釋配成9.0、3.0、1.0 g·L-13種濃度藥液備用;麝香保心丸，上海和黃藥業有限公司，取1 g加入無血清RPMI 1640中研磨制成20 ml混懸液，1 500 r·min-1離心去沉淀，再用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，4℃保存;Matrigel，BD公司;RPMI 1640培養基，美國Gibco公司產品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3主要儀器 CO2細胞培養箱，美國Thermo公司;倒置顯微鏡，日本Nikon公司;超低溫高速離心機D-37520，德國Heraeus公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 HUVEC細胞接種到50 ml玻璃培養瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37℃、體積分數為0.05的CO2的培養箱內培養。當培養瓶細胞長到80%左右時用胰蛋白酶(含EDTA)消化傳代。加入體積分數0.1的胎牛血清及1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基懸浮細胞，以1×108·L-1的密度接種到新細胞培養瓶中，輕輕置于培養箱內培養。選取3～8代生長狀態良好的細胞用于模型制備。

1.2.2細胞缺氧/復氧損傷模型制備及分組 根據文獻［4］的方法，采用氧清除劑連二亞硫酸鈉造成缺氧，種板培養24 h后，各孔棄去培養基，用無糖Earle's液洗細胞2次，正常對照組加入RPMI 1640培養基;模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1×10-3mol的無糖 Earle's液，造成細胞缺氧損傷［5］;陽性藥對照組加入麝香保心丸(SBW，2 g·L-1)，MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1×10-3mol的無糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1)，37 ℃孵育 4 h;取出培養板，吸棄各實驗孔液體，用無糖Earle's液洗細胞2次，各實驗孔均換含藥的無血清 RPMI 1640培養基，繼續培養12 h，造成細胞復氧損傷。

1.2.3細胞生長狀況檢測 6孔培養板每孔接種1×105個HUVEC，培養24 h待其貼壁后，每孔改用含10%胎牛血清培養液同步化處理24 h后并按上述方法進行處理，收獲細胞，加入終濃度為100 μg的RNA酶，37℃水浴30 min后，加入終濃度50 μg的PI熒光染料避光染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.4內皮細胞體外遷移實驗 HUVEC在缺氧4 h復氧12 h后收獲，按文獻方法［6］24孔板每孔加入600 μl正常培養基，放置小室，向小室中加入細胞懸液 100 μl(1 ×108·L-1)，模型組加入等量 PBS，陽性藥物組加入SBW，各給藥組加入大、中、小劑量的MOO，每組均設置3個復孔，37℃培養4 h。去除濾膜上層細胞，用體積分數0.95的乙醇固定后胎盤藍染色。顯微鏡下計數濾膜下表面的細胞數，隨機選取8個視野。

1.2.5內皮細胞體外小管形成實驗 參照文獻［6］的方法。HUVEC在缺氧復氧處理后收獲，制成2×107·L-1細胞懸液。96孔板每孔加入50 μl Matrigal，37℃條件下溫育4 h后每孔加入上述細胞懸液100 μl，模型組加入等量 PBS，陽性對照組加入SBW，MOO各組分別加入大、中、小劑量的MOO，每組均設置3個復孔，37℃條件下培養。18 h后觀察各組細胞管狀排列狀況及管狀結構數量、完整程度，并隨機選取5個視野，應用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野總的小管面積數量，結果以與模型對照組相比的百分數表示。

1.2.6統計學處理計量資料數據用±s表示，采用統計學軟件SPSS 16.0進行方差齊性檢驗、單因素方差分析，組間用LSD法進行兩兩比較。

2 結果

2.1缺氧復氧損傷對HUVEC細胞形態學的影響正常培養的HUVEC細胞核圓，核膜清晰，呈鋪路石樣單層生長模式;缺氧復氧模型后，細胞形態不規則，細胞部分脫落，間隙變大，單個細胞體積膨大，胞膜呈粗糙褶皺狀，有拉絲現象;SBW組大部分脫落，MOO各劑量組對HUVEC細胞缺氧復氧損傷均顯示出不同程度的保護作用。

2.2流式細胞儀檢驗細胞生長狀況如Tab 1所示，正常組與缺氧復氧模型組G2+S期的細胞分別占(26.25±1.44)%和(50.07±4.07)%，兩者差異有顯著性(P＜0.05);MOO大、中劑量G2+S期細胞為(28.24±2.13)%和(34.23±2.56)%，與模型組差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of MOO on cell cycle in HUVECS injured by hypoxia/reoxygenation

2.3巴戟天對缺氧復氧損傷條件下的細胞遷移的影響如Tab 2所示模型組與正常組相比，細胞遷移數量明顯減少(P＜0.05);MOO各劑量組可明顯增加缺氧復氧模型組細胞的遷移數目(P＜0.05)。陽性對照藥組未表現出促進缺氧復氧損傷的內皮細胞遷移的作用。

Tab 2 Effect of MOO on migration of cells injured by hypoxia/reoxygenation(xˉ±s)

2.4MOO對缺氧復氧損傷細胞小管形成的影響如Tab 3所示，正常組與模型組細胞形成的管腔結構數量差別有統計學意義(P＜0.05)，模型組與給藥組相比差別亦有統計學意義(P＜0.05)，SBW組細胞狀態不好，未見有小管形成(Fig 1)。

3 討論

治療性血管新生是指在心衰、心肌缺血、心肌梗死的狀態下，通過一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用增加功能性的冠狀動脈分支或側支循環的建立或開放，達到恢復缺血心肌血供的目的，它為冠心病患者帶來了一種新的治療策略［7］。內皮細胞對于血管新生有著很重要的作用［8-9］，故本實驗選用HUVEC為研究對象。

Fig 1 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation

Tab 3 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation(xˉ±s)

細胞凋亡是心肌細胞急性損傷過程中心肌細胞丟失造成心肌受損的重要原因，抗細胞凋亡可以對抗心肌的急性缺氧/復氧損傷［10］。巴戟天能夠對缺氧/復氧過程中的心肌細胞的形態具有保護作用［11］。本實驗結果也顯示各劑量組MOO處理后在未增加細胞G2+S期比例情況下卻能減少細胞脫落，表明巴戟天糖鏈具有抑制細胞凋亡和促進內皮細胞增殖的雙重作用，從而起到保護缺血心肌的作用。

血管新生是一個復雜過程，單就內皮細胞而言，主要有遷移、增殖和管腔形成等幾個步驟［12］。缺血缺氧是誘導血管形成的原因之一［13］，而血管內皮細胞的遷移和管腔形成是血管新生的重要環節［14］，促進內皮細胞遷移和小管形成，可能是促治療性血管生成的機制之一［15］。本實驗結果顯示，在缺氧復氧損傷情況下細胞的遷移卻受到了抑制，遷移的細胞數量不足正常條件下的一半，而巴戟天糖鏈能夠在缺氧復氧損傷條件下促進細胞遷移，使遷移的細胞數量維持在一個很高的水平。同時在小管形成實驗中，缺氧復氧損傷模型組細胞在18 h后才開始相互連接，24 h未能在基質膠表面形成完整的管腔樣結構，而MOO大、中、小劑量組細胞培養6 h即可見有細胞間的相互連接形態，18 h在martrigel表面形成完整的管腔樣結構，并隨著濃度的增加和培養時間的延長，管腔結構增多，促進缺氧復氧損傷條件下的小管形成。這表明MOO促進血管內皮細胞血管新生，對MOO既往藥理研究有了進一步補充，為缺血心肌保護及促進缺血心臟建立側枝循環方面的作用提供了更加直觀的實驗依據。

本實驗中還存在問題，實驗中設定的陽性藥物麝香保心丸組(SBW)在本實驗中并沒有表現出來其應有的作用，可能是制備過程中或者給藥劑量方面的問題，我們將在下一步的實驗中對其查證或換用其他陽性藥物。

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