殼寡糖通過p38MAPK糖基化修飾抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8的表達

楊同寧，江躍全，楊火梅，3，李佳佳，楊 竹，3，曹緯國，朱 冰，唐云喬，于 超

(1.重慶醫科大學生命科學研究院，重慶 400016;2.重慶醫科大學第二附屬醫院胸心外科，重慶 400010;3.重慶醫科大學第二附屬醫院婦產科，重慶 400010)

血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)損傷是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管并發癥等眾多心腦血管疾病的始動環節或關鍵因素［1］。因此，發現和使用能夠抑制IL-6、IL-8等炎癥因子的產生、阻止內皮細胞損傷的保護劑，是預防心血管疾病發生的重要策略。

殼寡糖(chitosan oligosaccharides，COS)系由氨基葡萄糖經β-1，4糖苷鍵縮合而成，是分子質量為2 ku以下的寡聚復合糖。研究表明，殼寡糖對小鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護作用［2］，能夠通過下調p38及ERK1/2磷酸化，抑制LPS所致HUVECs細胞IL-6的高表達［3］及 TNF-α 誘導的 HUVECs細胞VCAM-1、ICAM-1的表達增加［4］。但是殼寡糖是通過何種機制抑制內皮細胞中炎性誘導所致的細胞因子高表達還不十分清楚。近年來，一些磷酸激酶由于其組成中絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)磷酸化位點通常也是O-連接的糖基化(O-GlcNAc)位點，因此，糖基化和磷酸化的競爭，對相應激酶產生雙向調節，影響其在信號轉導中的作用，并形成了所謂“陰-陽關系”學說。在蛋白質的O-GlcNAc糖基化過程中，O-連接 N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(O-β-N-acetylglucosaminyl transferase，OGT)發揮著重要作用，也是調節絲氨酸或蘇氨酸O-GlcNAc糖基化的關鍵酶［5］。有研究顯示，葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)可誘導HUVECs細胞的蛋白質O-GlcNAc修飾，抑制NF-κB的磷酸化;降低 TNF-α誘導的血管內皮細胞VCAM-1的表達;葡萄糖胺也可通過蛋白的OGlcNAc修飾，保護心臟的缺血/再灌流損傷，而OGT抑制劑alloxan可阻止此過程［6-8］，說明細胞內功能蛋白的糖基化在轉錄后調節過程中起到非常重要的作用。

殼寡糖是否可以影響糖基轉移酶(OGT)的表達，調控信號通路中部分磷酸激酶，降低其磷酸化水平，從而抑制炎癥因子的表達，值得深入研究。本實驗通過TNF-α誘導EA.hy926內皮細胞促進IL-6、IL-8表達，模擬血管內皮炎癥模型，探討殼寡糖保護血管內皮細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1材料RPMI1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司;生長因子HAT購自Sigma公司;殼寡糖及糖胺由中國科學院大連化學物理研究所提供;腫瘤壞死因子(TNF-α)購自Prospec-Tany Technogene公司;細胞裂解液(TRIzol)及RT-PCR逆轉錄、擴增試劑盒(TaKaRa)購自寶生物工程(大連)有限公司。IL-6、IL-8 ELISA試劑盒購自欣博盛生物有限公司;蛋白裂解液及兔抗β-actin抗體購自CST公司;抗-OGT，抗-t-p38 MAPK，抗-Phospho-p38(pp38)等抗體購自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)公司。p38 抑制劑(SB203580)購自Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA，USA)公司。

1.2方法

1.2.1EA.hy926血管內皮細胞的培養 EA.hy926內皮細胞培養于含胎牛血清的RPMI1640培養基(含105U·L-1青霉素，105U·L-1鏈霉素，30 mg·L-1HAT生長因子添加物)中，置于培養箱中培養，胰酶消化傳代。

1.2.2RT-PCR檢測IL-6、IL-8 mRNA的表達 采用TRIzol法提取總RNA，測RNA濃度。取1 μg逆轉錄，條件:37℃，15 min;85℃，5 s。IL-8(292 bp)引物序列:上游引物5'-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT-3';下游引物5'-TCT CAG CCC TCTTCA AAA ACT TCT C-3'。擴增條件:94℃，30 s;60℃，30 s;72 ℃，30 s;30 循環。IL-6(497 bp)引物序列:上游引物5'-TGA CAA ACA AAT TCG GTA CAT CC-3';下游引物5'-ATC TGA GGT GCC CAT GCT AC-3'。擴增條件:94℃，45 s;54 ℃，45 s;72℃，45 s;30循環。內參GAPDH(230 bp)引物序列:上游引物5'-CTC TCT GCT CCT CCT GTT CGA CAG-3';下游引物5'-GTG GAA TCA TAT TGG AAC ATG T-3'。擴增條件:94℃，30 s;54 ℃，30 s;72℃，30 s;30循環。PCR產物電泳后，通過凝膠成像儀(GelDoc 2000，Bio-Rad，USA)分析結果 。

1.2.3ELISA方法檢測培養液中IL-6、IL-8蛋白的分泌 分組處理細胞后收集培養液，按照說明書中實驗步驟操作，于450 nm波長處測定。每個實驗組均設置3個重復試驗。

1.2.4Western blot分析 收集細胞，用CST裂解液裂解細胞，收集蛋白。測蛋白濃度。蛋白樣品在水中沸煮10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳，用0.45 μm的PE膜轉膜，然后用脫脂奶粉封閉1 h，在4℃，分別與抗t-p38，p-p38，OGT，β-actin等抗體孵育過夜，用PBST漂洗3次后，與辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育1 h。漂洗后，用 ECL化學發光法，在Chem GelDoc成像儀(Bio-Rad，USA)分析結果。

1.2.5統計學分析 每個實驗至少重復3次，應用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，結果采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗分析，多組間比較用方差分析法處理數據。

2 結果

2.1TNF-α誘導EA.hy926細胞表達IL-6、IL-8為了確定TNF-α誘導EA.hy926細胞產生IL-6、IL-8 mRNA表達的合適時間。細胞經不同時間的TNF-α(40 μg·L-1)處理后，采用RT-PCR的方法檢測IL-6、IL-8的表達。與對照組相比TNF-α處理組IL-6、IL-8的表達均明顯升高(Fig 1)。其中2 h處理組IL-6、IL-8的表達量最高，分別是對照組的8.05倍和6.09倍(P＜0.01)。因此，實驗中除特殊說明均采用40 μg·L-1TNF-α處理細胞2 h作為實驗模型。

Fig 1 TNF-α induced IL-6 and IL-8 mRNA expression in EA

2.2殼寡糖抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8的表達細胞采用不同濃度殼寡糖(50～200 mg·L-1)預處理24 h，再用40 μg·L-1TNF-α刺激2 h。殼寡糖呈濃度依賴方式明顯降低IL-6、IL-8 mRNA表達(Fig 2A)。與TNF-α刺激組相比，200 mg·L-1殼寡糖預處理組的IL-6、IL-8 mRNA表達量分別下降到1/4、1/7(P＜0.05)。表明在轉錄水平上殼寡糖可以抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8 mRNA的表達。

在蛋白表達水平，用ELISA方法檢測培養液中分泌的IL-6、IL-8蛋白，得到相似結果(Fig 2B)，與對照組相比，TNF-α刺激組細胞分泌的IL-6、IL-8蛋白量明顯上升。而殼寡糖處理組與TNF-α刺激組相比則按濃度依賴方式明顯降低。表明殼寡糖抑制TNF-α誘導EA.hy926細胞IL-6、IL-8的蛋白表達與轉錄水平結果一致。

2.3殼寡糖抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞p38MAPK信號通路的激活為了驗證殼寡糖是否能夠抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞p38MAPK信號通路的激活，并與抑制IL-6、IL-8表達相關。細胞經200 mg·L-1的殼寡糖預處理24 h，再用TNF-α刺激30 min。結果發現與對照組相比(Fig 3)，TNF-α刺激組磷酸化p38蛋白量增加2.0倍(P＜0.05)，而殼寡糖處理組磷酸化p38蛋白水平與TNF-α刺激組比較下降了1/2(P＜0.05)。結果說明殼寡糖對 TNF-α誘導的 EA.hy926細胞p38MAPK信號通路的激活有明顯的抑制作用。

Fig 2 Effects of COS on IL-6 and IL-8 mRNA(A)and protein(B)expressions of EA hy926 induced by TNF-α

Fig 3 Effects of COS on p38MAPK phosphorylation of EA hy926 induced by TNF-α

2.4TNF-α誘導EA.hy926細胞IL-6、IL-8的表達與p38MAPK通路密切相關將細胞用p38MAPK抑制劑SB203580(25 μmol·L-1)預處理1 h，然后經 TNF-α 刺激2 h，結果與 TNF-α 刺激組比較(Fig4)，抑制劑組和200mg·L-1的殼寡糖預處理組相同，使IL-6、IL-8的表達恢復到接近空白對照組的水平(P＜0.01)。說明TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8 mRNA的表達與p38MAPK信號通路激活密切相關，殼寡糖可能通過抑制p38磷酸化來調節IL-6、IL-8的表達。

Fig 4 Effects of p38MAPK inhibtor SB203580 on IL-6 and IL-8 mRNA expression of EA hy926 induced by TNF-α

2.5殼寡糖抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞OGT的表達下降殼寡糖可抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞p38MAPK信號通路的激活，而蛋白質O-GlcNAc糖基化和O-磷酸化之間具有共同的修飾位點。為了分析二者在殼寡糖調控下的關系，將細胞用200 mg·L-1的殼寡糖處理24 h后，再用TNF-α刺激30 min，結果OGT的表達與對照組相比，TNF-α刺激組明顯下調(Fig 5)，降到對照組的1/3(P＜0.05)，而殼寡糖處理組為 TNF-α組的1.76倍(P＜0.05)。表明殼寡糖具有恢復 TNF-α誘導EA.hy926細胞OGT表達下調的作用。

Fig 5 Effects of COS on OGT expression of EA hy926 induced by TNF-α

2.6葡萄糖胺抑制TNF-α誘導EA.hy926細胞IL-6、IL-8 mRNA的表達為了進一步驗證蛋白OGlcNAc修飾與IL-6、IL-8 mRNA表達相關，細胞采用可以促進蛋白O-GlcNAc修飾并降低磷酸化水平的葡萄糖胺［8］處理 4 h，再用 TNF-α 刺激 2 h，結果不同濃度(1～10 mmol·L-1)葡萄糖胺處理組與TNF-α 刺激組相比(Fig 6)，IL-6、IL-8 mRNA 表達均明顯降低(P＜0.05)。表明這個過程可能與增加激酶O-GlcNAc修飾有關。說明殼寡糖至少部分通過對蛋白激酶O-GlcNAc修飾調控TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8的表達。

Fig 6 Effects of Glucosamine on IL-6 and IL-8 mRNA expressions of EA hy926 induced by TNF-α

3 討論

心血管系統疾病是當今人類健康最主要的威脅之一。而血管內皮細胞損傷是心腦血管疾病的始動環節或關鍵因素。在內皮細胞損傷過程中，炎癥因子表達是加重損傷的關鍵環節，其中IL-6、IL-8在招募免疫細胞發揮炎癥反應中起著重要作用。因此，如何降低損傷，抑制IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌，也是當今預防心血管系統疾病發生的關鍵［9-12］。本實驗首次證明了殼寡糖可能通過p38MAPK糖基化修飾調控TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8的表達。

以往研究表明殼寡糖可通過調節p38及ERK1/2 MAPK通路激酶磷酸化抑制 LPS-誘導HUEVCs細胞 IL-6的表達［3］;葛根素可通過調節p38及ERK1/2MAPK通路激酶磷酸化抑制LPS-誘導 HUEVCs細胞 IL-6、IL-8 的表達［13］，說明細胞中p38蛋白磷酸化水平的升高可以促進IL-6、IL-8的表達。而功能蛋白O-連接糖基化和磷酸化共同的絲氨酸/蘇氨酸位點的修飾之間存在的“陰-陽關系”提示我們，殼寡糖能否通過調控p38蛋白磷酸化或糖基化水平影響IL-6、IL-8的表達?而解決這個問題的關鍵就是要闡明殼寡糖是否能夠影響催化糖基化反應的關鍵酶-OGT的表達。我們研究結果顯示TNF-α誘導EA.hy926細胞表達IL-6、IL-8與p38磷酸化蛋白上調密切相關，殼寡糖能夠通過抑制p38磷酸化蛋白上調而降低IL-6、IL-8的表達，這個調控過程與糖基轉移酶OGT的上調呈正相關。表明殼寡糖可能通過對p38蛋白磷酸化或糖基化的相互作用完成對p38MAPK信號的調控，從而影響TNF-α誘導細胞的IL-6、IL-8表達。為了進一步驗證此假設，實驗中還采用了能夠增加蛋白質糖基化修飾作用的葡萄糖胺處理細胞，因為有研究表明［14］葡萄糖胺可通過OGT途徑增加蛋白質糖基化修飾，抑制內皮細胞LL-37誘導的ERK磷酸化，起到保護受損細胞的作用。結果證明葡萄糖胺可以抑制TNF-α誘導的EA.hy926細胞IL-6、IL-8的表達，這可能與葡萄糖胺可通過OGT途徑增加蛋白質O-糖基化修飾有關。而殼寡糖作為小分子的寡聚復合糖，抑制炎癥因子表達的方式可能與葡萄糖胺有相似的機制。這可能是殼寡糖發揮抗炎作用的一條重要通路。殼寡糖是通過直接與膜上受體結合進而調控OGT的表達，還是進入細胞內通過調控相關信號通路而影響糖基化的具體機制仍需進一步研究。另外，殼寡糖對功能蛋白O-GlcNAc糖基化水平及其他信號傳導通路的影響也有待深入研究。

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