胡黃連素硝酮對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

萬(wàn)賽男，江曉間，盧肖宇，蔣 杰，王玉強(qiáng)，于 沛，任俊蘭，徐立朋

(1.暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東廣州 510632;2.廣東華南新藥創(chuàng)制中心，廣東廣州 510663)

胡黃連素(apocynin，Apo)，又稱夾竹桃素，是傳統(tǒng)中藥胡黃連的主要藥用成分，常用于治療糖尿病、高血壓、呼吸系統(tǒng)疾病［1-3］。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是呼吸系統(tǒng)疾病中常見(jiàn)的疾病之一，肺內(nèi)聚集的大量中性粒細(xì)胞被激活，經(jīng)“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生大量氧自由基和活性氧引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)，被認(rèn)為在ALI的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［4］。Apo作為一種抗氧化劑可以清除自由基，重建體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡，起到治療ALI的作用。已有研究表明［5］，胡黃連素主要是通過(guò)抑制NADPH氧化酶活性來(lái)發(fā)揮藥理作用。Apo通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶亞基表達(dá)，從而抑制ROS的產(chǎn)生，達(dá)到減少超氧陰離子對(duì)肺組織損傷的目的。有文獻(xiàn)報(bào)道［3］NADPH氧化酶在高氧所致的急性肺損傷中起著關(guān)鍵作用。另外也有研究證明［6］Apo能夠抑制中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶的活性，防止ROS的產(chǎn)生，對(duì)肺缺血/再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

近期研究表明Apo在心腦血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)系統(tǒng)疾病、軟骨組織病變和癌癥等方面有潛在的治療作用，關(guān)于Apo的結(jié)構(gòu)修飾研究和結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究卻鮮有報(bào)道。選擇目前已知有效的ROS清除劑，作為輔助官能團(tuán)與Apo形成軛合物，我們合成了胡黃連素新型硝酮類(lèi)衍生物，深入研究AN-1在抗氧化損傷等方面是否比原化合物具有更好的效果。本研究通過(guò)觀察胡黃連素及其硝酮衍生物對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7損傷的保護(hù)作用、細(xì)胞內(nèi)ROS的變化和NADPH氧化酶亞基 gp91phox表達(dá)的影響，以及在治療LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型中的作用來(lái)闡明其抗氧化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 RAW 264.7細(xì)胞株購(gòu)于中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2動(dòng)物 SPF級(jí)♂SD大鼠，40只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自廣東省動(dòng)物中心。

1.1.3藥品和試劑 胡黃連素，純度≥98%，購(gòu)自浙江省臺(tái)州市東東醫(yī)藥化工有限公司，胡黃連素硝酮衍生物，由本研究所合成，經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度≥98%;用DMSO溶解受試藥物，加無(wú)血清培養(yǎng)基配制，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，使用時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至應(yīng)用濃度(DMSO終濃度≤1%);RIPA裂解液，PMSF，BCA蛋白定量試劑盒，總SOD活性檢測(cè)試劑盒，DCFH-DA活性氧試劑盒購(gòu)自江蘇海門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所;LPS(Escherichiacoli0111:B4)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Purified Mouse Anti-gp91phox購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，Actin鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) NeoMarkers公司;PVDF膜購(gòu)自 PALL公司;ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.1.4主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(REVCO，USA);酶標(biāo)儀(Bio-RAD680，USA);激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss 510 META DUO SCAN，Germany);美國(guó)伯樂(lè)迷你型電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清且含有青霉素1×105U·L-1和鏈霉素100 mg·L-1的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用0.25%胰酶消化。

1.2.2動(dòng)物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后，分別于 d 1和 d 16，氣管內(nèi)滴注 LPS(1 mg·kg-1)建立大鼠急性肺損傷模型，假手術(shù)(Sham)組滴注等量生理鹽水，將所有大鼠分為4組:假手術(shù)組、LPS組、Apo(3 mg·kg-1)+LPS組及 AN-1(5 mg·kg-1)+LPS組。于d 2～15，Sham組與LPS組大鼠分別灌胃1 ml的生理鹽水。在Apo(3 mg·kg-1)+LPS組，灌胃等體積Apo(3 mg·kg-1);AN-1(5 mg·kg-1)+LPS組，灌胃等體積AN-1(5 mg·kg-1)。所有的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定均在d 17進(jìn)行［9］。

1.2.3MTT法檢測(cè)AN-1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7制備成細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/100 μl的密度接種于96孔板中，生長(zhǎng)24 h后，除正常組(Control)和模型組(t-BHP)外，分別用不同濃度Apo(0.1、1 和 10 μmol·L-1)、AN-1(0.1、1 和 10 μmol·L-1)預(yù)處理1 h后，除正常組其余組加入200 μmol·L-1t-BHP誘導(dǎo)24 h，之后每孔加入終濃度為0.5 g·L-1的MTT溶液孵育4 h，加入150 μl DMSO待紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm吸收光波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，分析各組細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。細(xì)胞相對(duì)存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/正常組吸光度值)×100%。

1.2.4DCFH-DA熒光探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的變化 細(xì)胞接種于共聚焦平皿，生長(zhǎng)24 h后，除正常組(Control)和模型組(t-BHP)外，分別用不同濃度Apo(0.1、1 和 10 μmol·L-1)、AN-1(0.1、1 和 10 μmol·L-1)預(yù)處理1 h后，除正常組其余組加入200 μmol·L-1t-BHP誘導(dǎo)24 h，采用對(duì)活性氧敏感的熒光探針2'，7'-二氫二氯熒光素(DCFH-DA，終濃度為20 μmol·L-1)標(biāo)記細(xì)胞，37℃ 孵育 30 min，PBS洗3遍去除背景，立即用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描分析測(cè)定，檢測(cè)選用的激發(fā)波波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm，于40倍鏡觀察，利用含有圖像處理系統(tǒng)和自動(dòng)攝像的裝置選取不同視野拍攝圖像，所有掃描圖像存入計(jì)算機(jī)硬盤(pán)以便分析備用。

1.2.5Western blot法檢測(cè)胡黃連素衍生物對(duì)NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)的影響 細(xì)胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，生長(zhǎng)24 h后，除正常組(Control)和 模型組(t-BHP)外，分別用不同濃度Apo(0.1、1 和 10 μmol·L-1)、AN-1(0.1、1 和 10 μmol·L-1)預(yù)處理1 h，除正常組其余組加入200 μmol·L-1t-BHP誘導(dǎo)24 h，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入含有1 μmol·L-1PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解 10 min，10 000 ×g、4℃離心 10 min，取上清，BCA法蛋白定量，加入含溴酚藍(lán)的上樣緩沖液100℃變性，即收獲總蛋白。按30 μg蛋白每孔上樣。配制SDS-PAGE膠:5%濃縮膠，12%分離膠。電泳:濃縮膠80 V，分離膠100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)分離膠底部，停止電泳。濕法轉(zhuǎn)膜:恒流100 mA 60 min。5%的牛奶TBST室溫封閉1 h，加鼠來(lái)源抗gp91phox以及β-actin一抗(1∶2 000)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗PVDF膜5遍，山羊抗鼠二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗PVDF膜5遍，加ECL發(fā)光液，暗室顯影。用凝膠圖像分析軟件Image J對(duì)gp91phox蛋白表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析，以gp91phox條帶的積分光密度與βactin的比值代表gp91phox的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6病理學(xué)觀察 大鼠麻醉后，放血處死動(dòng)物，取出右肺下葉放入4%甲醛中固定，固定后進(jìn)行脫水、透明與包埋后石蠟切片，HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.7肺組織SOD活性測(cè)定 采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肺組織SOD活性。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行，均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法中的LSD檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1AN-1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞損傷的保護(hù)作用濃度為200 μmol·L-1的t-BHP可以明顯損傷 RAW 264.7細(xì)胞，Apo和 AN-1 0.1，1，10 μmol·L-1預(yù)處理1 h后對(duì)RAW 264.7細(xì)胞損傷顯示不同程度保護(hù)作用。如Fig 1所示，與t-BHP組相比，Apo在 10 μmol·L-1起保護(hù)作用，而 AN-1 在 1和 10 μmol·L-1時(shí)都起保護(hù)作用(P＜0.05)，且在10 μmol·L-1時(shí)作用明顯，表明胡黃連素經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)。

Fig 1 Protective effect against t-BHP induced damages in RAW 264.7 cells(xˉ±s，n=3)

2.2AN-1降低RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平叔丁基過(guò)氧化氫處理RAW 264.7后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高，熒光強(qiáng)度明顯增加。如Fig 2所示，經(jīng)Apo和AN-1預(yù)處理1 h后均可抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的形成，但是Apo清除自由基效果不明顯，隨著AN-1濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性減弱，在高濃度10 μmol·L-1時(shí)作用效果最為明顯。

2.3AN-1可抑制t-BHP誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NADPH氧化酶亞基gp91phox活性的升高叔丁基過(guò)氧化氫處理 RAW 264.7細(xì)胞后，可激活細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶亞基gp91phox，表達(dá)量近為正常組兩倍(P＜0.01)，經(jīng)AN-1和Apo預(yù)處理細(xì)胞后，可以明顯降低RAW 264.7內(nèi)NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)，僅在 0.1 μmol·L-1時(shí)，AN-1 就可以達(dá)到降低gp91phox表達(dá)的目的(P＜0.05)，在1 μmol·L-1或 10 μmol·L-1時(shí)，AN-1 和 Apo 均可抑制t-BHP誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞的gp91phox表達(dá)量的升高(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn) Fig 3。

2.4AN-1對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用從肺大體觀可以看出LPS可引起嚴(yán)重的肺腫大，而AN-1治療組和Apo治療組均能改善LPS介導(dǎo)的肺腫大現(xiàn)象，肺體積大小與空白組相當(dāng)，明顯小于模型組(數(shù)據(jù)未列出)。病理切片結(jié)果Fig 4顯示與Sham組比較LPS導(dǎo)致組肺組織明顯受損，肺泡間隔增寬，肺泡完整性被破壞，AN-1治療組的肺泡及肺泡囊結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，肺泡間僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Apo治療組的炎癥現(xiàn)象也得到改善。結(jié)果表明，AN-1比Apo具有更好的治療急性肺損傷的作用。

Fig 2 ROS-scavenging effect in RAW 264.7 cells(×400)

Fig 3 Effects of Apo and AN-1 on gp91phox expression in RAW 264.7 cells(ˉx ± s，n=3)

Fig 4 Protective effect in LPS-induced lung damage in rats by Apo and AN-1(HE，×50)

2.5AN-1對(duì)肺組織中SOD活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 5)顯示，LPS組的肺組織SOD活性較Sham組明顯降低(P＜0.01)。與LPS組比較，Apo+LPS組能改善肺組織中SOD的活性(P＜0.05)，而AN-1+LPS組可提高SOD活性(P＜0.01)。

3 討論

急性肺損傷是最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)急癥之一，NADPH氧化酶介導(dǎo)的超氧陰離子產(chǎn)生在其發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。LPS攻擊動(dòng)物肺部后，肺組織丙二醛(MDA)含量增加、SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性降低，大量炎癥因子產(chǎn)生，可以造成肺泡毛細(xì)血管膜損導(dǎo)致多形核中性粒細(xì)胞的附著、激活與積壓，同時(shí)影響氣體交換并最終導(dǎo)致呼吸衰竭［7-8］。

Fig 5 AN-1 attenuated the decreased SOD activity in lungs by the administration of LPS(±s，n=8)

研究報(bào)道顯示［9］Apo對(duì)LPS誘導(dǎo)“兩次打擊”肺損傷的大鼠具有明顯的保護(hù)作用，可以提高大鼠的存活率，降低血清和肺組織中MDA含量，下調(diào)髓過(guò)氧化物酶活性。此外也有研究表明，LPS可以上調(diào)豬肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)、活性氧和炎癥因子的產(chǎn)生，而胡黃連素作為NADPH氧化酶抑制劑，可以降低LPS誘導(dǎo)豬肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ROS含量，抑制炎癥因子的產(chǎn)生［10］。本研究所發(fā)現(xiàn)［11］硝酮衍生物，如川芎嗪的硝酮衍生物TBN可明顯保護(hù)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。基于硝酮結(jié)構(gòu)化合物的抗氧化活性，合成了胡黃連素的硝酮衍生物AN-1，實(shí)驗(yàn)證明AN-1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞損傷模型中有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，與t-BHP 組相比，Apo 在 10 μmol·L-1起保護(hù)作用，而AN-1在1和10 μmol·L-1時(shí)都起保護(hù)作用(P＜0.05)，且在 10 μmol·L-1時(shí)作用更加明顯，表明胡黃連素經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)。為了進(jìn)一步研究AN-1是否通過(guò)抑制NADPH氧化酶活性來(lái)發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞損傷的作用，我們進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)和NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)量的測(cè)定，激光共聚焦結(jié)果顯示AN-1清除細(xì)胞內(nèi)ROS的作用比Apo更明顯;免疫印記結(jié)果表明AN-1仍然是有效的NADPH氧化酶抑制劑。基于前面的研究，為了進(jìn)一步證明AN-1在動(dòng)物體內(nèi)的治療效果，我們進(jìn)行了AN-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型的保護(hù)作用研究，病理結(jié)果顯示LPS組大鼠肺組織肺泡腔塌陷，肺泡隔明顯增寬，見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);肺間質(zhì)水腫，血管管壁增厚。給予Apo治療后大鼠肺損傷較LPS組明顯減輕，而給予AN-1治療后，可以有效減輕水腫和出血，肺泡間隔趨于正常組，并且AN-1可以明顯提高LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織的SOD活性，結(jié)果表明AN-1治療效果優(yōu)于Apo。

綜上所述，胡黃連素的硝酮衍生物通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)，抑制NADPH氧化酶劑的活性，從而可以達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的目的。在治療LPS誘導(dǎo)急性肺損傷模型中的優(yōu)勢(shì)也證明胡黃連素的硝酮衍生物是一個(gè)新型有效的自由基清除劑。

［1］Unger B S，Patil B M.Apocynin improves endothelial function and prevents the development of hypertension in fructose fed rat［J］.Indian J Pharmacol，2009，41(5):208-12.

［2］Cotter M A，Cameron N E.Effect of the NAD(P)H oxidase inhibitor，apocynin，on peripheral nerve perfusion and function in diabetic rats［J］.Life Sci，2003，73(14):1813-24.

［3］Carnesecchi S，Deffert C，Pagano A，et al.NADPH oxidase-1 plays a crucial role in hyperoxia-induced acute lung injury in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，180(10):972-81.

［4］王 樂(lè)，劉 偉，廖琳玲，等.地昔帕明對(duì)小鼠內(nèi)毒素急性肺損傷的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(1):63-6.

［4］Wang L，Liu W，Liao L L，et al.Influence of desipramine on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):63-6.

［5］Stefanska J，Pawliczak R.Apocynin:molecular aptitudes［J］.Med Inflamm，2008，2008:106507.

［6］Dodd-o J M，Welsh L E，Salazar J D，et al.Effect of NADPH oxidase inhibition on cardio pulmonary bypass-induced lung injury［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287(2):H927-36.

［7］許 敏，李志超，董明清，等.丹參酮IIA磺酸鈉對(duì)脂多糖致小鼠急性肺損傷的預(yù)防與治療作用及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(4):477-81.

［7］Xu M，Li Z C，Dong M Q，et al.The preventive and therapeutical effect of STS on ALI induced by LPS in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(4):477-81.

［8］王 平，張建新，李蘭芳，等.硫化氫對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(9):1232-6.

［8］Wang P，Zhang J X，Li L F，Jin P L，et al.Effect of hydrogen sulfide on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1232-6.

［9］Zhou R，Hu D H，LIU L M，Zhou X W.Protective effects of apocynin on“two-hit”injury induced by hemorrhagic shock and lipopolysaccharide［J］.Aeta Pharmacol Sin，2002，23(11):1023-8.

［10］Muzaffar S，Shukla N，Angelini G，Jeremy J Y.Nitroaspirins and morpholinosydnonimine but not aspirin inhibit the formation of superoxide and the expression of gp91phoxinduced by endotoxin and cytokines in pig pulmonary artery vascular smooth muscle cells and endothelial cells［J］.Circulation，2004，110(9):1140-7.

［11］Sun Y W，Jiang J，Zhang Z Z，et al.Antioxidative and thrombolytic TMP nitrone for treatment of ischemic stroke［J］.Bioorg Med Chem，2008，16(19):8868-74.