納米銅對腎細胞的氧化損傷作用

廖明陽，劉華鋼

(廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021)

納米藥物既是國際科學前沿，也是與人類健康和生活密切相關的重要社會問題，充滿了創新的機遇。與傳統分子藥物相比納米藥物的最大優點在于，納米藥物利用納米顆粒的小尺寸效應、容易進入細胞而實現高療效;納米藥物的比表面積大、鏈接或載帶的功能基團或活性中心多，可以實現治療與療效跟蹤同步化;材料的性能優越，便于生物降解或吸收;納米具有的多孔、中空、多層等結構特性，易于藥物緩釋控制等［1］。但納米藥物作為運用納米技術(特別是納米化制備技術)研究開發的一類新的藥物制劑，在呈現誘人的納米生物效應的同時，其安全性問題也不容忽視。納米銅是代表性的金屬納米材料之一，已經作為商業化產品進入市場多年。在生物醫學領域中有望代替銅化合物或微米銅材料應用到畜類飼料添加劑［2］、抗骨質疏松及抗衰老的納米藥物和宮內節育器等方面［3］。在前期研究中，我們已經發現納米銅能夠引起大鼠腎臟的毒性損害［4～6］，本研究中我們進一步利用體外腎細胞模型，探討氧化應激在納米銅引起腎細胞毒性中的作用。

1 材料與方法

1.1材料納米級銅粉，購自深圳尊業納米有限公司;人近端腎小管上皮細胞系(HK-2)為本室保存。谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物酶(SOD)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2納米銅分散方法將準確稱重的納米銅粒子加入試驗用培養基中制成母液(終濃度10 g·L-1)，物理混勻，采用水浴超聲分散30 min，結束后立即取適量稀釋為試驗所用濃度。

1.3細胞培養細胞在含 10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，37℃，5%CO2條件下培養傳代。細胞生長至85%～90%融合時，分別給予不同濃度的納米銅處理，設對照組。

1.4細胞內活性氧檢測采用熒光探針DCFH-DA標記流式細胞術檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成。熒光染料DCFH-DA能自由擴散進入細胞，被酯酶水解成DCFH，有活性氧存在時刻被氧化成DCF，其熒光強度與細胞內活性氧的含量呈正相關。分別收集納米銅作用2、24 h的貼壁細胞，PBS輕洗3次，細胞重懸于0.5 ml PBS，取儲存于 -20℃、溶于 DMSO的 DCFH-DA儲存液 (1 mmol·L-1)2.5 μl加入到細胞懸液中，終濃度為5 μmol·L-1，37℃ 孵育 30 min，用 PBS 漂洗 3 次，0.5 ml PBS重懸，立即用流式細胞儀測定DCFH-DA反應后細胞內DCF的平均熒光強度，激發波長448 nm，發射波長526 nm，每份樣品計數2×104個細胞。

1.5細胞內金屬硫蛋白表達免疫細胞化學法測定。將5×104細胞接種于預先置玻片的24孔板中培養24 h，此后加入不同濃度的納米銅懸浮液培養24 h，吸棄培養上清，PBS輕洗細胞2次后，用95%乙醇固定30 min，晾干，加入PBS作用5 min，取出玻片，濾紙輕吸干外周水分，滴加合適量的抗金屬硫蛋白抗體(1∶100稀釋)，采用PV二步染色法，操作按照試劑說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染，結束后中性樹脂封片照像，每次試驗均設陰性對照。

1.6氧化應激指標測定細胞生長在6孔板或者25 cm2的培養瓶中，分別加入納米銅懸浮液作用24 h，經胰酶消化，收集細胞，加細胞裂解液處理，離心取上清測定下列指標。培養上清則直接離心棄沉淀測定相關指標。測定方法嚴格按照試劑說明書執行，測定原理簡介如下。

1.6.1谷胱甘肽測定 二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應時能生成一種黃色化合物，412 nm進行比色定量測定。

1.6.2MDA測定 過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。

1.6.3銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應體系產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，可通過比色法定量。

1.7 數據統計數據采用±s表示，利用SPSS10.0軟件進行單因素的ANOVA分析，先作方差齊性檢驗，若方差齊再進行單因素多水平方差分析，各組間比較采用Dunnett’t檢驗。

2 結果

2.1納米銅粒子氧化能力分析將0～40 mg·L-1納米銅與HK-2細胞作用2、24 h，測定細胞內活性氧的生成量，結果見Fig 1。由圖可知，納米銅可以劑量依賴性方式誘導細胞內ROS含量升高。

Fig 1 The changes of ROS generation in HK-2 cells after nano-copper exposed(n=3)

2.2納米銅對細胞金屬硫蛋白(metallothinein，MT)表達的影響金屬硫蛋白是細胞對金屬作用的一種應激性反應，免疫細胞化學法分析結果顯示20 mg·L-1納米銅與細胞作用24 h，細胞內MT表達均明顯增強，結果見Fig 2，可見MT主要分布在細胞漿，呈棕黃色顆粒物。

Fig 2 The changes of the expression of metallothionein in cell after nano-copper exposed HK-2 cells

2.3納米銅對氧化應激相關因子的影響將0～40 mg·L-1納米銅與HK-2細胞作用24 h，測定細胞氧化應激相關指標的變化，結果見Tab 1，可見細胞內GSH，培養上清中的MDA水平均呈劑量依賴性升高，而細胞內 MDA、CuZn-SOD水平升高不明顯。

Tab 1 Indicators of oxdative stress measured after nano-copper 24 h exposed(±s，n=3)

Tab 1 Indicators of oxdative stress measured after nano-copper 24 h exposed(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Nano-copper Concentration/mg·L-1 Supernatant MDA/μmol·L-1 Cell MDA/μmol·g-1Pro GSH/mg·g-1Pro CuZn-SOD/kU·g-1Pro 0 1.18±0.26 1.58±0.54 27.81±0.60 2.09±0.37 5 1.76±0.19 1.73±0.38 34.27±4.08 2.17±0.53 10 1.99±0.21* 1.79±0.25 43.73±14.10* 2.31±0.58 20 2.46±0.35＊＊ 1.72±0.27 47.83±11.37* 2.06±0.63 40 2.39±0.47＊＊ 2.09±0.13 52.60±4.48*2.20±0.71

3 討論

目前，國內外對納米銅的生物安全性及其機制已經展開了初步的探討，結果顯示無論是對人或生態系統，納米銅潛在的毒性均不容忽視［7～9］。由于納米材料具有小尺寸-大比表面積的特性，因此，普遍認為氧化應激可能是納米材料引起毒性損傷的重要機制之一。在腎臟，腎近端小管上皮細胞因為其特殊的結構和功能成為外源性化合物誘導腎毒性過程中的敏感靶位點，腎小管上皮細胞已經成為研究化合物腎毒性的可靠細胞模型。本研究中我們利用人近端腎小管上皮細胞(HK-2)觀察了氧化應激作用在納米銅引起腎細胞損傷中的作用。

活性氧是一系列化學性質活潑、氧化能力強的含氧物質的總稱。它是由氧直接或間接轉變的氧自由基及其衍生物，包括氧的單電子反應產物、H、H2O2·OH-及其衍生物1O2及膜質過氧化中間產物LO·、LOO·、LOOH等比分子氧活潑的物質［10］。生物體內活性氧的生成與清除處于動態平衡狀態，當各種因素打破這一平衡而導致活性氧濃度超過生理限度時就會損傷生物大分子，包括脂質過氧化、DNA的氧化損傷、蛋白質的氧化和單糖氧化等，從而導致各種疾病發生。本研究中發現納米銅可以劑量依賴性方式誘導細胞內ROS含量升高，提示細胞內活性氧的動態平衡發生偏移。

金屬硫蛋白是一類低分子量，富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，普遍存在于真核細胞中，它是肝、腎細胞內主要的銅結合蛋白，對銅有高親合力(7～10 g atoms/mol)。主要負責螯合細胞內游離的銅離子。隨著人類對金屬硫蛋白的了解逐漸深入，其在機體內的基本功能已經達到共識:清除自由基、抗擊電離輻射的作用、重金屬的解毒作用、參與微量元素的代謝、參與機體應激反應、增強機體對抗不良狀態的適應能力、影響 DNA復制、轉錄及蛋白質的合成，抗細胞凋亡作用等［11］。本研究利用免疫細胞化學法分析發現，20 mg·L-1納米銅與細胞作用24 h，細胞內MT表達均明顯增強，這是細胞的一種應激性保護反應，提示納米銅暴露后細胞內銅離子以及活性氧含量的增加。

此外，本研究還發現，納米銅引起細胞內和細胞培養液內MDA含量升高，提示細胞的脂質成分發生了氧化改變，證實了納米銅引起的細胞損傷與其產生的自由基的氧化損傷作用有關。MDA是脂質過氧化反應終產物，其水平高低代表脂質過氧化強度和速率，脂質過氧化反應是發生在多聚不飽和脂肪酸上的系列自由基反應。脂質過氧化是氧自由基造成組織細胞損傷的主要途徑之一，測定脂質過氧化發生的程度，可作為判斷自由基致細胞損傷的一個指標。

谷胱甘肽(GSH)是組織細胞內重要的抗氧化物，GSH可清除超氧陰離子、H2O2等自由基，以保護含巰基的酶和蛋白質免受氧化損傷［12］。SOD是機體重要的抗氧化酶，其活性高低與機體抗氧化損傷能力相關［13］。本研究中發現，作為一種代償性反應，納米銅暴露后細胞內GSH和SOD含量升高，但并不足以抵抗納米銅引起的活性氧等自由基增加，最終仍表現出細胞的氧化損傷。

綜上所述，納米銅在一定劑量和暴露時間條件下確實破壞了腎細胞內活性氧與抗氧化物質的動態平衡，引起氧化應激，這可能與納米銅引起的毒性損傷有關。

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