五味子乙素對染矽塵大鼠肺組織一氧化氮水平和誘導型一氧化氮合酶mRNA表達動態變化的影響

樊林花，劉田福，郭 民，劉茂林

(山西醫科大學實驗動物中心，山西太原 030001)

石英粉塵可使機體產生大量活性氧自由基(ROS)，而使機體處于氧化應激狀態，誘發巨噬細胞釋放大量細胞因子、炎癥介質［1］。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種氧化劑、一種炎癥介質在氧化應激和組織損傷過程中的作用已得到越來越多證明［2］。體內過量NO主要由誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化產生［3］。iNOS基因上游有多種核轉錄位點，其中最主要的是核轉錄因子(NF-κB)結合位點［4］，前期研究表明，Sch-B對染矽塵大鼠肺損傷有保護作用［5］，可抑制NF-κB的活化［6］，我們推測 Sch-B可能參與 iNOS的表達過程。為進一步探討其抑制染矽塵大鼠肺損傷的作用機制，本實驗觀察了Sch-B對染矽塵大鼠肺組織NO水平和iNOS表達的動態變化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑Sch-B(成都曼斯特生物科技有限公司，純度 ＞98%);SiO2(美國 Sigma公司，純度99%;用生理鹽水配成50 g·L-1混懸液經高壓蒸汽滅菌后，用前加青霉素20 000 U·L-1);RNAiso Plus總RNA提取試劑、RT試劑盒、Taq酶和dNTP(寶生物工程大連有限公司);iNOS和GAPDH引物序列由北京奧科生物公司合成;NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2主要儀器PTC-200PCR儀、水平電泳儀、凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)，微量離心機(德國eppendorf公司)，高速冷凍離心機3-18K(美國Sigma公司)，萊卡切片機(德國Laica公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)，T6新世紀型紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)

1.3動物分組、模型建立及標本的收集選用我中心前期復制的大鼠實驗性矽肺模型石蠟塊，共96例。對照組(Control)、染矽塵組(Silica)和Sch-B組(Sch-B)各32例，采用暴露式氣管內注入法染塵，染矽塵組和Sch-B組每只大鼠注入1 ml SiO2混懸液，對照組注入1 ml滅菌生理鹽水。染塵后d 1 Sch-B組開始灌胃給予Sch-B 8 mg·(100 g)-1·d-1，其余各組給予等容橄欖油。每周復查體重，調整給藥劑量。各組于給藥后d 3、7、14和28隨機取8只，腹主動脈采血致死，經右心灌注生理鹽水沖洗肺內血液，生理鹽水漂洗，記錄肉眼病理變化。取左肺中段用于HE染色，其余肺組織于液氮中速凍后存于-80℃冰箱，以備RT-PCR和肺組織NO測定。

1.4肺組織NO含量的測定采用硝酸還原酶法，按照試劑盒說明書操作。

1.5肺組織病理學檢查石蠟切片作HE染色觀察肺組織基本病理學改變。

1.6RT-PCR檢測肺組織中iNOS mRNA表達剪取凍存的肺組織100 mg，按RNAiso Plus試劑說明書操作，提取總RNA，反轉錄成cDNA，然后進行PCR擴增，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為內參照。iNOS上游引物:5'-GCATCCCAAGTACGAGTGGT-3';下游引物:5'-CCATGATGGTCACATTCTGC-3'，產物長度308 bp;GAPDH上游引物:5'-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3';下游引物:5'-GATGACCTTGCCCACAGCCTTG-3'，產 物 長 度 213 bp。取2 μ l擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統對擴增產物進行掃描，分別測定每一個目的基因及GAPDH的吸光度值，取iNOS與GAPDH的吸光度比值為iNOS mRNA相對含量。

1.7統計學分析采用SPSS 16.0統計軟件分析，數據以±s表示，相同時間點多組間的比較用單因素方差分析及t檢驗。

2 結果

2.1各組肺臟組織病理學變化對照組大鼠雙肺呈粉紅色，表面光滑柔軟，彈性良好，肺內結構清晰，各觀察點均未出現明顯改變。染矽塵組大鼠肺呈蒼白色，硬度增加，有出血點，表面粗糙不平，彈性減弱，染塵后d 3表現為明顯的炎癥，可見肺泡壁水腫，肺泡內巨噬細胞和中性粒細胞增多;d 7肺泡間隔增厚，伴有巨噬細胞、淋巴細胞為主的細胞浸潤，間質內成纖維細胞增多;d 14肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔變窄，成纖維細胞增生，膠原基質明顯增多，纖維化開始發生;d 28肺泡結構破壞，肺泡壁顯著增厚，肺泡結構破壞或消失，肺組織以膠原沉積、肺纖維化改變為主。Sch-B組大鼠肺組織色澤較均勻，表面稍粗糙，彈性尚可，肺組織結構病變程度較同期模型組明顯減輕。

2.2染塵后不同時間點肺組織NO含量和iNOS表達的動態變化NO含量在染塵后各個時間點與對照組相比均明顯升高(P＜0.01)，其中在d 7時達到高峰后開始下降，iNOS mRNA的變化與NO含量類似，但iNOS mRNA的峰值出現在d 14(見Tab 1、2)。

2.3Sch-B對染矽塵大鼠肺組織不同時間點NO含量和iNOS表達的作用Sch-B組各時間點NO含量都明顯低于相應的染矽塵組(P＜0.05或P＜0.01);各時間點iNOS mRNA表達也都低于相應的染矽塵組，但只在d 3和7時差異有統計學意義(P＜0.05)，在d 14和28時差異沒有統計學意義(見Tab 1、2 和 Fig 1)。

3 討論

本實驗以暴露式氣管內注入二氧化硅粉塵復制了大鼠矽肺纖維化模型，經大體肺組織標本外觀形態觀察和HE染色顯示，染矽塵組大鼠病理特征與文獻報道一致［7］，說明造模成功。Sch-B組與染矽塵組相比，大鼠肺結構損傷明顯減輕，未見明顯纖維化改變，從組織形態學角度說明Sch-B對染矽塵大鼠肺纖維化具有一定的抑制作用。

Tab 1 Effect of Sch-B on NO content in lung homogenates of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

Tab 1 Effect of Sch-B on NO content in lung homogenates of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs silica

Group NO content in lung at different time points/μmol·g-1Pro d 3 d 7 d 14 d 28 Control 1.95±0.43 1.87±0.46 1.79±0.47 1.97±0.48 Silica 4.87±0.45＊＊ 6.21±1.04＊＊ 4.89±1.14＊＊ 5.01±0.74＊＊Sch-B 2.92±0.60＊＊△△ 3.30±0.99＊△△ 3.47±1.22＊＊△ 3.27±0.89＊＊△△

Tab 2 Effect of Sch-B on expression of iNOS mRNA in lung of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

Tab 2 Effect of Sch-B on expression of iNOS mRNA in lung of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05 vs silica

Group mRNA expression of iNOS in lung at different ti me points d 3 d 7 d 14 d 28 Control 0.12±0.05 0.11±0.08 0.13±0.03 0.10±0.02 Silica 0.37±0.13＊＊ 0.47±0.22＊＊ 0.53±0.20＊＊ 0.33±0.07＊＊Sch-B 0.23±0.12△ 0.21±0.14△ 0.44±0.19＊＊ 0.27±0.11＊＊

Fig 1 Expression of iNOS mRNA in lung tissue of different group rats at different time points

有研究表明［8］，NO參與了矽肺早期的炎癥反應過程，并與肺纖維化的形成密切相關。本實驗結果顯示:染矽塵組各時間點大鼠肺組織NO含量均較相應的對照組明顯升高，說明NO在整個肺纖維化形成與發展過程中起一定作用，而Sch-B干預后NO含量較染矽塵組明顯降低，進一步證明Sch-B可通過降低NO水平來干預早期的肺泡炎癥、改善后期的肺纖維化。

誘導性一氧化氮合酶是一類與炎癥反應關系密切的酶，主要在病理及炎癥狀態下發揮作用。在多種炎癥因子、內毒素等體液性物質的誘導下，iNOS mRNA過量表達，一旦誘導合成，即可持續翻譯合成iNOS，催化機體產生過量 NO［3］，iNOS/NO 體系的變化與炎癥反應密切相關［9，10］。本實驗顯示:染矽塵組各時間點iNOS mRNA大量表達，其肺組織NO含量明顯上升，遠高于各時間點對照組大鼠NO水平，說明染矽塵大鼠肺組織NO含量增多可能主要與iNOS mRNA過量表達有關。實驗還表明，各時間點肺組織NO含量和iNOS mRNA表達水平呈動態變化，但兩者峰值在時間上不具有同步性，NO含量在染塵后7 d時達到高峰，而iNOS mRNA表達水平在染塵后7 d時明顯升高，14 d時達到高峰，這可能是由于實驗樣本量較少所致。經Sch-B干預后，iNOS mRNA表達水平在d 3和7時較染矽塵組明顯降低，肺組織NO含量在各個時間點均明顯降低，提示Sch-B在染塵初期對iNOS的作用明顯，其原因可能是在染塵初期，肺組織損傷主要表現為氧化應激和肺泡炎，此時給予Sch-B干預能抑制肺組織氧化損傷，降低炎性因子的分泌，進而減少對iNOS的誘導和NO的合成和釋放，但隨著肺泡炎的減輕，肺纖維化的出現，Sch-B對iNOS的抑制作用不明顯，但對肺組織NO含量仍有明顯的抑制作用，可能是染塵后期，Sch-B可使NO含量減少是通過減輕炎癥作用導致的，并沒有涉及iNOS的誘導，這有待更深入研究。

綜上所述，本實驗闡明了大鼠染矽塵后NO和iNOSmRNA的動態變化規律及使用Sch-B后對動態變化的影響，初步探討了Sch-B抑制NO和iNOS mRNA的時間規律，這為進一步選擇合適時機干預矽肺纖維化進程提供依據，同時提示Sch-B在染矽初期對NO的影響，是由于Sch-B抑制了iNOS mRNA轉錄水平，其進一步作用機制可能是通過同時干預NF-κB的活化水平，最終降低細胞內iNOS mRNA表達及NO的誘導性合成與釋放，減輕炎癥反應程度，而發揮抗纖維化作用的，但后期NO的降低并不能單純以抑制iNOS mRNA轉錄水平來解釋。

［1］Fubini B，Hubbard A.Reactive oxygen species(ROS)and reactive nitrogen species(RNS)generation by silica in inflammation and fibrosis［J］.Free Radic Biol Med，2003，34(12):1507-16.

［2］吳向起，楊解人.芝麻素的抗氧化作用及其對代謝綜合癥大鼠腎病的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(8):1065-97.

［2］Wu X Q，Yang J R.Antioxidation and renoprotective effect of sesamin in metabolic syndrome rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):1065-97.

［3］Vuolteenaho K，Moilanen T，Hamalainen M，et al.Regulation of nitric oxide production in osteoarthritic and rheumatoid cartilage.Role of endogenous IL-1 inhibitors［J］.Scand J Rheumatol，2003，32(1):19-24.

［4］Kleinert H，Pautz A，Linker K，et al.Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase［J］.Eur J Pharmacol，2004，500(1-3):255-66.

［5］李曙芳，劉田福，郭 民，等.五味子乙素對二氧化硅致大鼠肺損傷的保護作用［J］.中國比較醫學雜志，2009，19(5):30-4.

［5］Li S F，Liu T F，Guo M，et al.Protection of Schisandrin B against Silica-induced lung injury in rats［J］.Chin J Comp Med，2009，19(5):30-4.

［6］李曙芳，劉田福，郭 民，等.五味子乙素對染矽塵大鼠肺組織MAPKs和NF-κB信號轉導通路的影響［J］.中華勞動衛生職業病雜志，2010，28(5):329-33.

［6］Li S F，Liu T F，Guo M，et al.Effect of Schisandrin B on mitogenactivated protein kinases and nuclear factor-κB in rat lungs exposed to silica［J］.Chin J Ind Hyg Occup Dis，2010，28(5):329-33.

［7］初 令，李 翔，胡永斌，等.大鼠實驗性矽肺早期生長反應基因表達及其作用的初步探討［J］.中華勞動衛生職業病雜志，2004，22(1):47-50.

［7］Chu L，Li X，Hu Y B，et al.Expression and role of early growth response gene-1 in experimental silicosis of rat［J］.Chin J Ind Hyg Occup Dis，2004，22(1):47-50.

［8］Mossman B T，Churg A.Mechanisms in the pathogenesis of asbestosis and silicosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998，157(5pt1):1666-80.

［9］夏曉東，吳立琴，徐 慧，等.羅紅霉素通過誘導型一氧化氮合酶/一氧化氮途徑抑制哮喘大鼠氣道炎癥［J］.中國藥理學通報，2009，25(9):1223-7.

［9］Xia X D，Wu L Q，Xu H，et al.Roxithromycin inhibited airway inflammation through pathway of inducible nitric oxide synthase and nitric oxide in rat asthmatic model［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(9):1223-7.

［10］Zeidler P，Hubbs A，Battelli L，et al.Role of inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide in silica-induced pulmonary inflammation and fibrosis［J］.Toxicol Environ Health A，2004，67(13):1001-26.