綠原酸對缺氧環境下干細胞來源軟骨樣細胞凋亡的影響

劉 哲，李士勇，宋玉林，廖新根，陳偉才，顧玉榮，殷 明

(南昌大學第二附屬醫院1.骨科、2.分子中心，江西南昌 330006)

軟骨細胞是構成關節軟骨的基礎，因其高度分化增殖能力低下造成軟骨的再生能力差，使得軟骨損傷后難以自然修復。干細胞及其來源軟骨細胞移植治療解決了軟骨細胞低增殖力問題，已成為臨床上治療軟骨損傷的有效方法［1］。研究發現體外氧環境下培養的細胞移植進入類似關節腔內缺氧環境［2］后活性及存活率均下降［3-4］，Wakitani等［5］認為移植細胞低存活率使得干細胞分化的軟骨的厚度、機械強度等均不及正常軟骨，所以細胞移植的低存活率是制約這一方法應用的因素。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)為苯丙素類極性有機酸，具有強抗氧化能力可抑制氧化應急引起的凋亡［6］。綠原酸對缺氧環境下細胞內活性氧改變引起的凋亡的作用，目前還不清楚。本實驗擬體外誘導骨髓間充質細胞為軟骨樣細胞，0.1%O2缺氧環境下模擬關節腔內的缺氧環境模型，觀察綠缺氧環境下原酸對軟骨樣細胞的作用，探討其對軟骨細胞的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑骨髓間充質細胞(BMSCs)全骨沖洗法取自健康SD大鼠(5周，♀，60 g)，南昌大學提供(清潔級);DMEM培養基、胰蛋白酶(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);骨形態發生蛋白-2(北京義翹神州生物技術有限公司);25 ml培養瓶、24孔板(Corning公司);Alcian Blue 8GX(索萊寶公司);一抗β-actin抗體、Ⅱ型膠原蛋抗體，二抗(博士德公司);PVDF膜0.45 μm(Millipore公司);ECL(Pierce公司);5x蛋白上樣緩沖液、活性氧檢測試劑盒、Hoechst33258染色試劑盒(碧云天生物技術研究所);Bcl-2、Caspase-3、β-actin的引物由上海生工生物科技有限公司合成，Bcl-2上游引物:5'-GGTACCGGAGAGCGTTCAGT-3'，下游引物:5'-CTGCTGCATTGTTCCCGTAG-3';Caspase-3上游引物5'-AGCTTCTTCAGAGGCGACTA-3':下游引物:5'-GGACACAATACACGGGATCT-3';β-actin上游引物:5'-TGTCA CCAACTGGGACGATA-3'，下 游 引 物:5'-GGGGTGTTGAAGGTCT-3'。

1.2實驗分組及藥物處理骨髓間充質干細胞全骨髓法取自健康SD大鼠，椎脫臼處死后體積分數為75%乙醇浸泡30 min消毒，無菌下取出四肢長骨，PBS沖洗，待沖洗液顏色不再加深后，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清加入10%FBS的DMEM重懸后滴入培養瓶貼壁培養，傳至第2代加入DMEM誘導培養基(含5%小牛血清、0.2 mg·L-1BMP-2)，置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱中，隔日換誘導液，12 d。0.1%O2缺氧是使用空氣混勻器，設定總氣體流量為2 000 ml·min-1，其中N2流量為1 880 ml·min-1，CO2流量為 100 ml·min-1，O2流量為20 ml·min-1，調整完畢后，將細胞培養瓶置于缺氧盒內，檢查完氣密性后沖入混勻低氧氣體，5 min后密閉缺氧盒以達到。實驗分4組:A(正常對照組):實驗中不加任何物質干預;B(綠原酸組):在細胞培養液中含終濃度為10 mg·L-1的綠原酸;C(缺氧處理組):實驗中不加任何物質干預置于0.1%O2缺氧環境下培養12 h;D(綠原酸+缺氧處理組):在細胞培養液中含終濃度為10 mg·L-1的綠原酸置于0.1%O2缺氧環境下培養12 h。

1.3Alcian Blue檢測軟骨分化Alcian Blue能夠特異性對硫酸葡萄糖胺聚糖(sulfate glyeosaminglycans)染色，是軟骨細胞特異性的染料。取誘導0 d、6 d、12 d的細胞，PBS洗兩遍，加1%Alcian Blue溶液染色30 min;3%冰醋酸溶液洗30 s×3;顯微鏡下觀察、拍照。

1.4Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白提取誘導前、誘導6 d、12 d細胞的蛋白，標準曲線測定樣品濃度，-20℃儲存;上樣量均為30 μg，90 伏 ～120 伏SDS-PAGE電泳(6%分離膠和5%的濃縮膠);250 mA恒流電轉膜3 h，5%牛奶封閉，分別一抗Ⅱ型膠原蛋抗體(1∶300)，二抗(1∶5 000)，堿性磷酸酶顯色系統顯色，顯定影后掃描分析。

1.5活性氧檢測各分組去除培養液后加入DMEM稀釋好的 DCFH-DA(終濃度為10 μmol·L-1)，37℃細胞培養箱內孵育20 min后吸盡液體，用無血清DMEM洗滌3次。使用熒光顯微鏡進行觀察(488 nm激發波長，525 nm發射波長)。

1.6Hoechst33258熒光染色觀察細胞凋亡各分組去除培養液PBS洗兩遍，吸盡，加入固定液10 min;吸盡后PBS洗2次，每次3 min，吸盡;加入Hoechst 33258染色15 min(置于搖床上)，吸盡;用PBS洗2次，每次3 min，吸盡;加入抗熒光淬滅封片液。熒光顯微鏡下檢測骨髓間充質細胞來源軟骨樣細胞凋亡情況(激發波長350 nm，發射波長460 nm)。隨機選取5個視野，計數100個細胞，計算細胞凋亡率/%=凋亡的細胞數/總的細胞數×100% ，取5次結果的平均值。

1.7RT-PCR檢測Bcl-2、Caspase-3的mRNA表達水平收集各分組細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA后PCR。PCR反應體系:Mix:10 μl，cDNA:1.5 μl，上下游引物各 1 μl，dd H2O:6.5 μl，總計 20 μl。取 PCR 產物，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳40 min，內參照為β-actin基因。使用GDS8000凝膠自動成像系統掃描分析并相應處理。

1.8統計學處理使用SPSS 14.0統計軟件進行統計學處理，計量資料以±s表示，差異性分析選用One-way ANOVA test進行分析。

2 結果

2.1Alcian Blue染色檢測BMP-2誘導BMSCs的軟骨分化Alcian Blue是軟骨細胞特異性染料，能夠對軟骨基質的特征性標志硫酸葡萄糖胺聚糖染色。光鏡下觀察:誘導前BMSCs經Alcian Blue處理未被染色，形態呈梭狀或類成纖維狀;誘導6 d后胞體較BMSCs變大呈不規則類圓形，呈淡染;誘導12 d較前胞體變大形態不規則，深染。說明在進行誘導后硫酸葡萄糖胺聚糖含量明顯增高且與誘導時間呈正比，間充質干細胞在誘導后可分化為軟骨細胞。見Fig 1A。

Fig 1A Evaluation after induction of differentiated chondrogenic MSCs

2.2Western blot檢測BMP-2誘導BMSCs表達Ⅱ型膠原蛋白Ⅱ型膠原蛋白(Collagen 2al，Col2a1)是軟骨分化過程中的特征性分子指標。結果顯示:誘導前BMSCs無Ⅱ型膠原蛋白的表達;誘導6 d后Ⅱ型膠原蛋白有較高的表達;誘導12 d細胞較誘導前Ⅱ型膠原蛋白表達有增加。說明經誘導培養后，間充質干細胞分化為軟骨樣細胞。見Fig 1B。

2.3活性氧檢測DCFH-DA入細胞后被酯酶水解成不能透膜的無熒光DCFH，其被細胞內活性氧氧化生成有熒光的DCF，DCF熒光水平即細胞內活性氧水平。熒光結果:A組:出現均勻的低強度熒光，細胞內活性氧水平低;B組:出現均勻的低強度熒光，與A正常對照組比較差別無統計學意義(P＞0.05)，細胞內活性氧水平低;C組:有大量的高強度的熒光，與正常對照組比細胞內活性氧水平急劇增高，有統計學意義(P＜0.05);D組:有較少量強度高的熒光，但較C組熒光強度明顯降低，比A、B組升高，具有統計學意義(P＜0.05)，說明綠原酸對更換低氧培養環境引起的細胞內活性氧增高有一定的保護作用;見Fig 2。

Fig 1B Expressions of typeⅡcollagen protein were examined at 0，6，and 12 days

Fig 2 Effects of CGA on ROS in differentiated chondrogenic MSCs

2.4Hoechst33258熒光染色觀察細胞凋亡Hoechst33258為可特異性結合DNA分子的水溶性熒光探針。凋亡細胞因核濃縮與Hoechst 33258結合增強，在熒光顯微鏡下染色呈強藍色熒光;正常細胞呈微弱熒光，死細胞不被染色。本實驗細胞熒光染色結果:A組:出現均勻的低強度熒光，細胞核較大，細胞凋亡率為(4.07±2.036)，凋亡細胞數目極少;B組:可見數目極少的較高強度的藍色亮點，細胞凋亡率為(6.89±2.503)，與A正常對照組比較差別無統計學意義(P＞0.05);C組:有數目較多的高強度的藍色亮點，細胞凋亡率為(87.92±19.08)，有大量的細胞發生凋亡，與正常對照組進行比較有統計學意義(P＜0.05);D組:有較少的強度高的藍色亮點，細胞凋亡率為(53.62±12.208)，與0.1%O2缺氧環境培養組進行比較凋亡細胞數目明顯減少，具有統計學意義(P＜0.05)，可見綠原酸對0.1%O2缺氧環境培養引起的凋亡具有一定的保護作用;見 Fig 3、4。

Fig 3 Hoechst33258 nuclear staining for assessment of apoptosis of chondrogenic MSCs

Fig 4 The rate of apoptosis in differentiated chondrogenic MSCs(n=5)

2.5RT-PCR檢測Caspase-3、Bcl-2的mRNA表達水平將各組處理12 h后:與A組進行比較，B組的Caspase-3的表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)。Bcl-2的表達水平有提高，有統計學意義(P＜0.05)說明綠原酸能上調骨髓間充質細胞來源的軟骨細胞的Bcl-2的低表達;與A組進行比較，C組的Caspase-3的表達水平增強、Bcl-2的表達水平明顯減弱，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，可見0.1%O2缺氧環境能促使骨髓間充質細胞來源的軟骨細胞Caspase-3表達增強、Bcl-2的表達減弱;D組與C組進行比較，D組的Caspase-3的表達水平明顯降低、Bcl-2的表達水平增強，差異均具有統計學意義(P＜0.05);D組與A組相比，D組的Caspase-3與Bcl-2表達增強，差異有統計學意義(P＜0.05)。說明綠原酸下調0.1%O2缺氧環境引起的Caspase-3的高表達以及上調0.1%O2缺氧環境引起Bcl-2的低表達;見Fig 5。

Fig 5 Effect of CGA on Bcl-2 and Caspase-3 expression in differentiated chondrogenic MSCs(n=5)

3 討論

Lengner等［7］使用BMP-2高密度培養的條件下夠誘導小鼠胚胎成纖維細胞MEFs分化為軟骨細胞，證實BMP-2具有誘導具有多向分化潛能的細胞向軟骨細胞分化的能力。本實驗采用0.2 mg·L-1BMP-2對骨髓間充質細胞進行誘導12 d。行軟骨細胞特異性Alcian Blue染色以及Ⅱ型膠原蛋白的檢查，誘導后的細胞Alcian Blue染色、Ⅱ型膠原蛋白均為陽性且與誘導時間成正比，說明誘導后骨髓間充質細胞分化為軟骨樣細胞。

關節腔損傷后其內為極低氧環境［2］，本實驗使用0.1%O2的缺氧環境來模擬這一環境。Greijer發現缺氧的嚴重程度直接決定著細胞凋亡與否，在0.5%O2的缺氧環境下可以啟動細胞的凋亡［8］，所以認為0.1%O2的缺氧環境可誘發細胞的凋亡。本實驗將誘導后的細胞放在0.1%O2的缺氧環境下進行培養12 h，凋亡率為87.92%，認為凋亡模型成立。

綠原酸(chlorogenic acid，CGA)為杜仲、金銀花等中藥中的主要有效成分，含有R-OH基，有消除羥基自由基、降低超氧陰離子等自由基的活性等的強抗氧化能力，對氧化應激引起的細胞凋亡起到保護作用［9］。本實驗中，未做處理的骨髓間充質來源軟骨樣細胞在0.1%O2的缺氧環境下進行培養12 h，凋亡率為87.92%。加入綠原酸終濃度為10 mg·L-1相同條件、時間下培養，其凋亡率為53.62%，較未加綠原酸處理組明顯下降。

Henrotin等［10］在實驗中發現更換氧濃度培養環境至極低氧環境下，培養液內氧張力急劇變化，活性氧等水、氧化還原狀態水平發生改變，可使細胞凋亡。線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡級聯反應中的早期表現，細胞內活性氧水平的變化可導致胞內氧化還原狀態改變，細胞液由還原環境轉為氧化環境這可能導致了凋亡早期細胞內線粒體膜電位的下降以并引發內質網脅迫等，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應［11-12］。實驗發現，在加入綠原酸后骨髓間充質細胞來源的軟骨樣細胞的細胞內活性氧水平檢測加綠原酸組亦明顯降低。

Bcl-2蛋白為凋亡抑制蛋白，通過調控谷胱甘肽的水平控核內氧化還原平衡從而控制Caspase的活性抑制凋亡［13］。Caspase是具有半胱氨酸殘基類似結構，能夠特異性的切割靶蛋白蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵的蛋白酶，在凋亡中起著關鍵作用，其中caspase-3是細胞凋亡中最重要的終末剪切酶［14］。本實驗發現在缺氧環境下加入綠原酸保護后Bcl-2表達水平明顯高于未加入，而caspase-3表達水平遠低于未加入組。

綜上所述，綠原酸可能通過降低超氧陰離子等自由基的活性水平以控制細胞內的活性氧水平，穩定細胞的氧化還原狀態來保護線粒體膜電位等，并促進凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達及抑制Caspase-3的表達，共同起到抗凋亡作用。隨著對綠原酸及抗凋亡基礎研究的不斷深入，為促進缺氧環境下種子細胞的存活能力的提高開辟思路和尋找到新策略。

［1］Pelttari K，Winter A，Steck E，et al.Premature induction of hypertrophy duringin vitrochondrogenesis of human mesenchymal stem cells correlates with calcification and vascular invasion after ectopic transplantation in SCID mic［J］.Arthritis Rheum，2006，54(10):3254-66.

［2］Pfander D，Swoboda B，Cramer T.The role of HIF-1 alpha in maintaining cartilage homeostasis and during the pathogenesis of osteoarthritis［J］.Arthritis Res Ther，2006，8(1):104.

［3］Follmar K E，Decroos F C，Prichard H L，et al.Effects of glutamine，glucose，and oxygen concentration on the metabolism and proliferation of rabbit adipose-derived stem cells［J］.Tissue Eng，2006，12(12):3525-33.

［4］Malladi P，Xu Y，Chiou M，et al.Effect of reduced oxygen tension on chondrogenesis and osteogenesis in adipose-derived mesenchymal cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，290(4):C1139-46.

［5］Wakitani S，Mitsuoka T，Nakamura N，et al.Autologous bone marrow stromal cell transplantation for repair of full-thickness articular cartilage defects in human patellae:two case reports［J］.Cell Transplant，2004，13(5):595-600.

［6］Liu D，Liu W，Zhu D，et al.Nitrogen effects on total flavonoids，chlorogenic acid，and antioxidant activity of the medicinal plant Chrysanthemum morifolium［J］.J Plant Nutr Soil Sci，2010，173(2):268-74.

［7］Lengner C J，Lepper C，Van Wijnen A J，et al.Primary mouse embryonic fibroblasts:a model of mesenchymal cartilage formation［J］.J Cell Physiol，2004，200(3):327-33.

［8］Greijer A E，van-der-Wall E.The role of hypoxia inducible factor 1(HIF-1)in hypoxia induced apoptosis［J］.J Clin Pathol，2004，57:1009-14.

［9］Pintea A，Rugin D，Prlog R，et al.Chlorogenic acid reduces oxidative stress in rpe cells［J］.Bull Univ Agric Sci Veter Med Cluj-Napoca Veter Med，2010，66(8):132-8.

［10］Henrotin Y，Kurz B，Aigner T.Oxygen and reactive oxygen species in cartilage degradation:friends or foes?［J］.Osteoarthritis Cartilage，2005，13(8):643-54.

［11］Sato T，Machida T，Takahashi S，et al.Fas-mediated apoptosome formation is dependent on reactive oxygen species derived from mitochondrial permeability transition in Jurkat cells［J］.J Immunol，2004，173(1):285-96.

［12］王曉琴，王振華，張 波，等.氧化還原調控在紫檀芪誘導HeLa細胞內質網凋亡途徑中的作用.［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1184-8.

［12］Wang X Q，Wang Z H，Zhang B，et al.The role of redox sensing in pterostilbene-induced HeLa cell apoptosis via endoplasmic reticulum pathway［J］.Chin Phamacol Bull，2010，26(9):1184-8.

［13］Zhang J，Alter N，Reed J C，et al.Bcl-2 interrupts the ceramidemediated pathway of cell death［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(11):5325-8.

［14］胡向陽，孟 剛，鮑楊漪，等.紫杉醇誘導Hela細胞凋亡及其與凋亡相關蛋白的關系［J］.中國藥理學通報，2004，20(9):1063-7.

［14］Hu X Y，Meng G，Bao Y Y，et al.Relationships between inducetion of apoptosis by Taxol in Hela cells and apoptosis-related proteins［J］.Chin Phamacol Bull，2004，20(9):1063-7.