亞硝酸鈉對人肝癌細胞增殖與凋亡的影響

張付利，厲永強，史 齊，李延紅，皇甫超申

(河南大學醫學院環境醫學研究所，河南開封 475004)

亞硝酸鈉是一種常見的亞硝酸鹽，廣泛存在于自然界水體、蔬菜中，在食品加工過程中常用作添加劑防腐和增加風味，同時也廣泛用于工業防腐和醫藥領域，因此廣受人們關注。亞硝酸鹽有可能與人體二級胺反應形成亞硝胺類物質，通常被認為有致癌作用。流行病學研究表明攝入過多的亞硝酸鹽有導致消化道癌發生和致畸的危險，由于一直缺乏有力的實驗支持，目前并不清楚亞硝酸鹽對癌細胞的確切作用［1］。最近發現，人體亞硝酸鹽不僅來自外源性飲水和食物，也可以由一氧化氮氧化內源性產生。亞硝酸鹽在人體缺氧或酸性環境下，可以還原為一氧化氮，因此，維持人體一定劑量的亞硝酸鹽可以調節生理機能，減輕心血管病的危害［2］。在這種背景下，研究亞硝酸鹽對癌細胞生物作用就顯得尤為迫切。課題組前期發現［3］，亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721增殖具有雙相劑量效應，但機制不清，為此，課題組對亞硝酸鈉誘導的人肝癌細胞SMMC-7721增殖、凋亡相關的早期增殖基因和缺氧誘導因子表達做了進一步研究。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑 亞硝酸鈉(NaNO2)，天津市晨福化學試劑廠(分析純);DMEM培養基(Gibco，with high glucose);新生牛血清，杭州四季青生物公司產品;二甲基亞砜(DMSO)，噻唑蘭(MTT)，Hochest33258購自Sigma公司;TRIzol試劑(美國 Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒(美國Promega公司)，Taq酶(美國MBI公司)，其他試劑均為國產或進口分析純。c-myc引物由上海生工合成。HIF-1α單克隆抗體購自碧云天生物有限公司，鼠抗雞囊(C4)βactin單抗、ECL Western blot化學發光檢測試劑盒均購自Santa Cruz公司。

1.1.2主要儀器 MK3型酶標儀(Labsystem，Helsink，芬蘭)，FACSSalibur流式細胞儀(BD，美國);BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本);UV-540紫外-可見分光光度計(UNICAM，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 肝癌細胞系SMMC-7721購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。細胞生長在含100 ml·L-1胎牛血清的 DMEM培養基中，置5%CO237℃培養箱培養。

1.2.2MTT細胞增殖分析 SMMC-7721細胞于5%CO237℃恒溫培養至對數生長期，用胰酶和EDTA消化，調整細胞數為1×1010cells·L-1接種到96孔細胞培養板，0.2 ml/孔，繼續培養24 h后換液，分別用含不同濃度亞硝酸鈉的DMEM培養液處理細胞(每個濃度5個復孔)，對照組只加培養液，繼續培養細胞48 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μl培養4 h后，吸去培養液，每孔加入150 μl DMSO于振蕩器上振搖，待蘭色晶體完全溶解后，在酶標儀上測定570 nm處的吸光度值(A值)并計算生長率。以含有等體積的培養液和DMSO的無細胞孔測得的吸光度值為空白對照，實驗重復3次。

1.2.3RT-PCR法檢測SMMC-7721細胞c-myc mRNA的表達 將SMMC-7721細胞種植于50 ml培養瓶中生長至亞融合狀態后，在含1%胎牛血清DMEM培養液中培養24 h，然后加入不同濃度的亞硝酸鈉作用24 h后收集細胞，采用異硫氰酸胍-酸性酚-氯仿抽提法提取總RNA，以β-actin為內參照，按RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。c-myc上游引物:5'-CAAGAGGCGAACACACAACGT CT-3'，下游引物:5'-AACTGTTCTCGTCGTTTCCGC-3'，擴增產物為 219 bp。β-actin上游引物:5'-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下 游 引 物:5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3'，擴增產物為516 bp。反應條件:94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸60 s，共進行30個循環。擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg·L-1溴乙錠)，膠片經光密度掃描，測定各條帶吸光度值，以β-actin作內參照，計算相對比值。

1.2.4Hoechst 33258單染分析細胞增殖分數 細胞以5×107cell·L-1濃度接種培養于預置蓋玻片(用0.1 g·L-1多聚賴氨酸處理)的6孔培養板內，每孔接種細胞數為1.5×105個。在不同時間點取出細胞爬片，經4%多聚甲醛固定、PBS沖洗、hoechst33258染色，紫外光激發，OLYMPUS-BX51熒光顯微鏡觀察。實驗重復3次，每張爬片隨機選5個視野，計數正常有絲分裂細胞占總細胞比例為細胞相對增殖分數。

1.2.5流式細胞術測定細胞凋亡 采用FITC-annexinⅤ/PI雙染法，分別收集各組細胞到10 ml的離心管中，每樣本細胞數為1×109·L-1，1 000×g離心5 min，棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，1 000×g離心5 min，用100 μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，1 000×g離心5 min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入annexinⅤ-FITC/PI溶液 5 μl 4℃下孵育 20 min，最后補 PBS 400 μl，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每個樣品檢測1萬個細胞，用cellquest軟件進行細胞凋亡分析。

1.2.6Western blot檢測HIF-1α蛋白表達 細胞于對數生長期加入各種濃度的亞硝酸鈉，作用24 h后用RIPA 200 μl充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍G-250法測樣品蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離電轉移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入各種一抗(1∶200)于4℃封閉袋中孵育過夜，二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，1∶4 000)孵育1 h?；瘜W發光法顯示結果，壓片曝光，凝膠圖像分析系統拍照，檢測蛋白質印跡條帶。

1.2.7統計學分析數據均采用±s表示，應用SPSS 12.0軟件包處理，經正態分布和方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析及兩兩比較t檢驗。

2 結果

2.1亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響MTT分析結果顯示，亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721增殖作用呈雙相劑量效應關系曲線(Fig 1)，低劑量刺激增殖，高劑量抑制增殖，最明顯的刺激細胞增殖作用出現在第24 h，最大促增殖效應為對照組的156%，IC50值為3 400 mg·L-1。

Fig 1 Cell proliferation in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite for 12，24，36，48 h(±s，n=3)

2.2亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721 c-myc mRNA表達的影響根據MTT實驗結果，從上述處理細胞的亞硝酸鈉濃度范圍內選取4個劑量，處理SMMC-7721細胞24 h，由 Fig 2可見，20、200 mg·L-1亞硝酸鈉處理組細胞c-myc mRNA表達量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，而800和3 400 mg·L-1亞硝酸鈉處理組細胞c-myc mRNA表達量與空白對照組差別無顯著性(P＞0.05)。

Fig 2 Expression of c-myc mRNA in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite for 24 h(±s，n=3)

2.3亞硝酸鈉對SMMC-7721細胞分裂指數和凋亡的影響用Hoechst 33258熒光染料對細胞染色質染色，熒光顯微鏡下可分辨分裂期細胞。用200 mg·L-1亞硝酸鈉作用SMMC-7721細胞24 h，細胞分裂指數為(6.88±1.2)%，與對照組(2.65±0.56)%相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。800 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞分裂指數為(2.76±1.1)%，比對照組略增高，但差異無顯著性(P＞0.05)，3 400 mg·L-1亞硝酸鈉作用24 h，細胞分裂幾乎被完全抑制，細胞分裂指數為(0.98±0.12)%，用實驗組細胞分裂指數與對照組分裂指數相比，得出細胞相對分裂指數制成柱狀圖見Fig 3C。流式細胞術分析結果見Fig 3F，200 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞凋亡率為(3.54±2.93)%(Fig 3B)，對照組細胞凋亡率為(5.98±2.16)%(Fig 3A)，經t檢驗，差異具有顯著性(P＜0.05);800 mg·L-1亞硝酸鈉作用24 h，細胞凋亡率為(6.55±3.12)%(Fig 3D)，比對照組高，但差異無顯著性(P＞0.05);3 400 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞凋亡率為(53.54±4.62)%(Fig 3E)，與對照組相比明顯升高(P＜0.05)。

Fig 3Mitotic and apoptosis efficiency in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite(±s，n=3)

2.4亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721 HIF-1α蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，正常培養的對照組SMMC-7721細胞有少量HIF-1α蛋白表達，亞硝酸鈉終濃度在20～800 mg·L-1范圍作用24 h，與空白對照組相比，細胞HIF-1α蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，而亞硝酸鈉終濃度在3 400 mg·L-1時，細胞HIF-1α蛋白表達量有所下降，但與空白對照組相比差異無顯著性(P＞0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Protein expression of HIF-1α in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite for 24 h(±s，n=3)

3 討論

MTT實驗發現，用終濃度20～200 mg·L-1范圍內亞硝酸鈉處理人肝癌SMMC-7721細胞24 h，可明顯促進細胞增殖，隨著時間延長，促增殖作用有所減弱，但皆可維持48 h。用200 mg·L-1亞硝酸鈉處理細胞24 h，細胞分裂指數增加，細胞早期增殖基因c-myc mRNA表達增加，結果表明，亞硝酸鈉在一定劑量下，對SMMC-7721細胞有促進增殖作用。

低劑量亞硝酸鈉促進細胞增殖作用可能與下列機制有關:①在培養體系內產生少量一氧化氮:一般認為，亞硝酸鈉在低劑量時是一種還原劑，在酸性或缺氧條件下，細胞利用酶或非酶途徑將亞硝酸鹽還原為NO［4］，低劑量的NO或低劑量亞硝酸根離子本身都是信號分子，具有刺激細胞增殖的效應［5］。本實驗是在普通培養條件下進行的，細胞培養24 h后，培養液pH值從7.3降至6.3左右，因此培養體系有可能產生少量一氧化氮。②刺激細胞分泌細胞因子:自分泌或旁分泌細胞因子是癌細胞的基本特征，借此無需外源性生長因子也能維持其自身生長和惡性表型轉化。有報道，亞硝酸鈉通過刺激胃癌細胞分泌 TNF、IL-6、IL-8發揮促進細胞增殖作用［6］，據此推測，亞硝酸鈉可能會促進 SMMC-7721細胞分泌細胞因子，促進細胞增殖。③增加細胞有氧糖酵解:低劑量亞硝酸鹽刺激細胞增殖的作用，與亞硝酸鹽及其還原的NO與線粒體呼吸鏈Ⅰ及Ⅳ結合，阻滯了呼吸鏈電子傳遞［7］，減少細胞內氧消費，細胞轉而采用糖酵解方式獲取能量［8］。本實驗發現低劑量亞硝酸鈉誘導c-myc mRNA表達增加，而c-myc能促進糖酵解通路上許多酶活性增加，促進細胞葡萄糖轉運，增加糖酵解，促進細胞增殖［9］。④促進細胞缺氧誘導因子表達:HIF-1是腫瘤細胞適應缺氧而產生的一種核轉錄因子，廣泛參與哺乳動物細胞中缺氧誘導產生的特異應答，在缺氧誘導的基因表達調節中起著關鍵作用。腫瘤中HIF-1上調糖轉運和糖酵解酶的相關基因，誘導血管生成因子表達增加，刺激細胞增殖。HIF-1除受缺氧調控以外，其他非氧依賴因素，如激素、生長因子、細胞因子、一氧化氮皆可調控其表達［10］。本實驗結果顯示，亞硝酸鈉在一定劑量范圍內可以促進SMMC-7721細胞HIF-1α蛋白的表達，提示低劑量亞硝酸鈉促進細胞增殖與其增加細胞HIF-1α蛋白的表達有關。

本次實驗還發現，200 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞凋亡率比空白對照組還要低，這可能與低劑量亞硝酸鹽抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ，減少活性氧產生有關［11］。

本實驗一個重要發現就是低劑量亞硝酸鈉促進細胞早期增殖基因c-myc和HIF-1α表達，有關這方面的研究目前尚未見報道。在生理情況下，HIF-1抑制c-myc的活性，但是在腫瘤缺氧微環境，HIF-1協同c-myc共同促進下游有關細胞增殖、能量代謝等相關基因的轉錄［12］。課題組認為，c-myc和HIF-1α協同參與了亞硝酸鈉促進細胞增殖作用，因為兩者都是細胞核轉錄因子，通常情況下以c-myc和HIF-1α復合體的形式協同作用，促進下游一系列與細胞增殖有關的基因表達，如血管生成因子和糖酵解有關的酶，而后兩者皆可促進細胞增殖［13］。

當亞硝酸鈉濃度超過800 mg·L-1時，呈現濃度依賴性的細胞增殖抑制效應。用3 400 mg·L-1(24 h時的IC50值)亞硝酸鈉處理SMMC-7721細胞24 h，大量細胞凋亡或壞死，說明亞硝酸鈉在高劑量時作為一種氧化劑，大量破壞細胞膜結構和染色質的完整性，由此導致細胞死亡，這種細胞死亡與細胞內大量產生活性氧有關［14］。本實驗還顯示，由于高劑量亞硝酸鈉導致細胞表達的c-myc mRNA和HIF-1α蛋白量與低劑量組相比有所下降，SMMC-7721細胞大量死亡，這從另外一個方面提示c-myc和HIF-1α參與了細胞增殖。

綜上所述，亞硝酸鈉對人肝癌SMMC-7721細胞呈現低劑量促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，高劑量抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的雙相劑量效應關系;早期增殖基因c-myc和缺氧誘導因子表達增加在低劑量亞硝酸鈉促進SMMC-7721細胞增殖過程中發揮重要作用。

［1］Hord N G，Tang Y，Bryan N S.Food sources of nitrates and nitrites:the physiologic context for potential health benefits［J］.Am J Clin Nutr，2009，90(1):1-10.

［2］Lundberg J O，Gladwin M T，Ahluwalia A，et al Nitrate and nitrite in biology，nutrition and therapeutics［J］.Nat Chem Biol，2009，5(12):865-9.

［3］孫玉生，史 齊，李延紅，等.低濃度亞硝酸鈉對人肝癌SMMC-7721細胞的毒物興奮性效應［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):419-20.

［3］Sun Y S，Shi Q，Li Y H，et al.Characterization of low dose sodium nitrite induced hormesis-like effects in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):419-20.

［4］Duranski M R，Greer J J，Dejam A，et al.Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver［J］.J Clin Invest，2005，115(5):1232-40.

［5］Bryan N S，Fernandez B O，Bauer S M，et al.Nitrite is a signaling molecule and regulator of gene expression in mammalian tissues［J］.Nat Chem Biol，2005，1(5):290-7.

［6］Sun J，Aoki K，Wang W，et al.Sodium nitrite-induced cytotoxicity in cultured human gastric epithelial cells［J］.Toxicol In Vitro，2006，20(7):1133-8.

［7］Raat N J，Noguchi A C，Liu V B，et al.Dietary nitrate and nitrite modulate blood and organ nitrite and the cellular ischemic stress response［J］.Free Radic Biol Med，2009，47(5):510-7.

［8］Jensen F B.Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish［J］.J Exp Biol，2007，210(19):3387-94.

［9］Dang C V，Le A，Gao P.MYC-induced cancer cell energy metabolism and therapeutic opportunities［J］.Clin Cancer Res，2009，15(21):6479-83.

［10］Kim J W ，Gao P ，Liu Y C，et al.Hypoxia-inducible factor 1 and dysregulated c-Myccooperativelyinduce vascularendothelial growth factor and metabolic switches hexokinase and pyruvate dehydrogenase kinase 1［J］.Mol Cell Biol，2007，27(21):7381-93.

［11］Shiva S.Mitochondria as metabolizers and targets of nitrite［J］.Nitric Oxide，2010，22(2):64-74.

［12］Podar K，Anderson K C.A therapeutic role for targeting c-Myc/Hif-1-dependent signaling pathways［J］.Cell Cycle，2010，9(9):1722-8.

［13］Zhang J，Sattler M，Tonon G，et al.Targeting angiogenesis via a c-Myc/hypoxia-inducible factor-1alpha-dependent pathway in multiple myeloma［J］.Cancer Res，2009，69(12):5082-90.

［14］Erkekoˇglu P，Baydar T.Effect of allyl isothiocyanate(AITC)in both nitrite-and nitrosamine-induced cell death，production of reactive oxygen species，and DNA damage by the single-cell gel electrophoresis(SCGE):does it have any protective effect on HepG2 cells［J］?.Int J Toxicol，2010，29(3):305-12.