頭孢曲松對甲基苯丙胺致大鼠行為及紋狀體氨基酸等遞質含量改變的影響

李成敏，顏 慧，高文靜，劉麗宏，宮澤輝

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850;2.第二炮兵總醫院藥學部，北京 100088)

谷氨酸(glutamic acid，Glu)是中樞神經系統內主要的興奮性神經遞質，對神經系統正常功能的維持起著重要作用［1］。釋放至突觸間隙的Glu可作用于NMDA、AMPA、KA等受體，參與從神經元傳遞到神經可塑性及神經病理異常等一系列生命過程［2-4］。Glu與多巴胺神經傳遞之間存在相互調節作用。研究表明［5-6］，METH不能直接對神經元產生興奮性毒性作用，然而它可以通過促進DA的異常釋放而增加細胞外Glu濃度進而對神經元產生損傷作用。在研究室前期研究發現，頭孢曲松可劑量依賴性的對抗嗎啡耐受和依賴的形成。本實驗探討了預防給予谷氨酸轉運體調節劑頭孢曲松對甲基苯丙胺急性處理致大鼠刻板行為及紋狀體中氨基酸等神經遞質的變化的影響。

1 材料

1.1動物Wistar大鼠40只，SPF級，♂，220～260 g。購自軍事醫學科學院動物中心，動物合格證號:SCXK-(軍)2007-004，動物飼養于SPF級動物房中，12 h明/暗交替，自由攝取食物和水。

1.2藥品與試劑METH由軍事醫學科學院楊征教授惠贈;頭孢曲松(ceftriaxone，Cef，生產批號:SH1150)，上海羅氏;多巴胺(Dopamine，DA)、高香草酸(Homovanillic acid，HVA)、3，4-二羥基苯乙酸(3，4-hihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、5-吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid，5-HIAA)，美國 Sigma公司;谷氨酸(glutamic acid，Glu)、甘氨酸(glycine，Gly)、伽瑪氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，美國Sigma公司;OPA，美國Acros公司;辛烷磺酸鈉，日本東京化成工業株式會社;自凝型義齒基托樹脂、自凝牙托水，上海賀利氏古莎齒科有限公司。

1.3主要儀器BAS清醒動物裝置、M2251(4 mm)型微透析探針、Ω-型腦內引導管(美國BAS公司);CMA120清醒動物裝置、CMA/100微量注射泵(瑞士CMA公司);KDS100型微量注射泵(美國KD Scientific公司);安捷倫1100系列液相色譜工作站(美國Agilent公司);C18反相色譜柱 ODS(5 μm，150 mm×4.6 mm，日本資生堂公司);Intro型電化學檢測器(荷蘭Antec Leyden公司);

2 方法

2.1動物處理40只大鼠適應實驗環境后隨機分為4組(n=10)，即鹽水組(NS組)，頭孢曲松組(Cef組)、METH急性處理組(METH組)，頭孢曲松預防給藥組(Cef+METH)。頭孢曲松組大鼠腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg-1，每天3次，連續3 d;METH急性處理組大鼠先腹腔注射生理鹽水1.0 ml·kg-1，每天2次，連續3 d，d 4急性給予METH 40 mg·kg-1;頭孢曲松預防給藥組大鼠先腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg-1，每天3次，連續3 d，d 4開始腹腔注射頭孢曲松后30 min再給予METH 40 mg·kg-1;鹽水組大鼠在相同時間內腹腔注射等體積的生理鹽水，每天2次，連續4 d。

2.2行為學觀察各組實驗動物均在給藥后密切觀察刻板行為并進行有關評分，10 min/次，觀察60 min，取平均值。模型組大鼠以實驗大鼠刻板行為評分≥2分為合格動物模型。刻板行為評分標準參考Sams-Dodd's刻板行為評分標準:0分，靜止不動，幾乎或根本無活動;1分，正常活動，偶爾有向前運動;2分，活動伴隨反復的向前探索，大鼠以一種刻板行為沿籠子周邊轉圈，且無其他行為;3分，繼續地向前探索;4分，重復地抬頭，搖頭或旋轉;5分，迅速地搖頭、旋轉或頭的背腹運動。

2.3流動相配制

2.3.1單胺類神經遞質測定用流動相配制35.7238 g檸檬酸(85 mmol·L-1)，16.406 g無水乙酸鈉(100 mmol·L-1)，0.1489 g Na2-EDTA(0.2 mmol·L-1)，0.3894 g 辛烷磺酸鈉(0.9 mmol·L-1)，溶于1 700 ml超純水中，濃HCl調節pH值至3.7，然后加入300 ml甲醇，經抽濾后使用。

2.3.2氨基酸類神經遞質測定用流動相配制 A液:28.65 g Na2HPO4，74.44 mg EDTA-2Na，溶解于2 L超純水中，并加入4 ml三乙胺，充分混勻，用磷酸調節pH值至6.3;B液:500 ml甲醇、100 ml四氫呋喃加入400 ml流動相A液，充分混勻，調節pH值至6.3;抽濾后使用。

0.1 mol·L-1四硼酸鈉溶液:3.8137 g Na2B4O7·10H2O溶于100 ml超純水中，用濃HCl調節pH值至9.6，0.22 μm針頭式濾器過濾后室溫保存。

OPA衍生化試劑:2.5 mg OPA溶于0.5 ml甲醇，加入0.5 ml的0.1 mol·L-1四硼酸鈉溶液，再加入4 μl的 β-巰基乙醇，混勻后4℃下避光保存。衍生化條件:20 μl樣品加入10 μl衍生化試劑，混勻，避光反應1.5 min。

2.4手術操作大鼠稱重并用戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1，ip)麻醉，俯臥位置于立體定位儀主框內。把兩側耳桿旋松并向外拉開，將鼠頭置于兩者之間，先將一側耳桿輕輕插入外耳道直至碰到骨性外耳道底，同樣插入另一側的耳桿。調整兩側耳桿，在左右讀數相同后旋緊耳桿上的固定螺絲。然后將大鼠的上門齒塞入上頜固定器的槽內并固定。剪去大鼠頭部的毛，以碘酒和酒精消毒，縱向切開頭皮，分離皮下組織，用3%H2O2浸濕的棉簽燒灼止血并充分暴露顱骨表面，調整上頜固定器的高度，使前囟中心和人字縫尖處于同一水平面，固定上頜固定器。以橫縱坐標定位前囟，進而參照腦立體定位圖譜確定紋狀體的坐標［7］(見 Fig 1所示):前囟前(AP)0.6 mm，前囟側(AL)±2.5 mm，在引導管上標記下插深度:顱骨面下3 mm(實際探針將下插7 mm);在所確定位置用手術鉆鉆孔，以恰鉆透顱骨為宜，垂直插入微注射引導管至合適深度。再在顱骨鉆孔位置周圍再鉆2個孔并擰上小螺絲，最后用牙科水泥固定。手術完畢每只大鼠肌肉注射青霉素8萬單位抗炎。動物術后單籠飼養，24～48 h進行給藥處理及透析。實驗分為4組:NS組，Cef組，METH急性處理組及Cef+METH組。

Fig 1 Location of rat striatum

2.5腦微透析-HPLC實驗方法連接好灌流用注射器、探針與收集管，確保整個系統通暢、無泄漏;大鼠乙醚麻醉，取出引導管內芯，小心插入探針;設置透析速率1.5 μl·min-1，平衡2.5 h后開始收集;每30 min采集一個樣品，每個樣品管內預先加入5 μl 1.1 mol·L-1高氯酸溶液以防止DA代謝降解(測量氨基酸樣品管內勿加高氯酸)。

透析平衡的同時打開液相色譜系統，設置流速1.0 ml·min-1;檢測氨基酸時調整流動相 A液70%，流動相B液30%，打開檢測器平衡待基線平穩后可進樣(DA最小檢測限＜240 fmol/sample)。基礎收集至連續3個采樣的測定值變異在10%以內時，可給藥并繼續收集透析樣品至6 h。透析結束，取出探針用水沖洗30 min可再用;大鼠斷頭取腦，浸于4%多聚甲醛固定后切片以鑒定探針位置，位置不正確者數據作廢。

2.6色譜條件電化學檢測器的工作電極為玻璃碳，參比電極為固態的Ag/AgCl。多巴胺類檢測工作電壓為 +0.70 V，流速為1.0 ml·min-1，柱溫25℃。

采用熒光分析方法梯度分離各種氨基酸，工作電極為玻璃碳，參比電極為固態的Ag/AgCl。柱溫18℃;開始時流動相 A液 100%，流速 0.8 ml·min-1;8 min時調整流動相B液55%，流速0.8 ml·min-1;25 min時流動相B液75%，流速1.0 ml·min-1;33 min時流動相 B液30%，流速1.0 ml·min-1;即如下表格所示:

Wavelength set for fluorescent detector:①excitation wavelength:340 nm;②emission wavelength:450 nm

2.7統計學方法在行為學評價實驗中，數據以±s表示;用Graphpad Prism 4.0軟件作圖并進行統計分析，采用Repeated one-way ANOVA及Bonferroni post tests后檢驗分析比較組間差異性。

在腦微透析實驗中，首先以各標準品濃度對色譜峰面積制作標準曲線，然后計算每組動物每個樣品的基礎透析濃度(±s);每只動物以各自基礎值為100%，給藥后每個時間點的測定值與之相比為該時間點的統計值(%，±s)。以重復測量的twoway ANOVA、three-way ANOVA方法及 Bonferroni post tests后檢驗進行統計分析。

3 結果

3.1METH急性處理對大鼠行為學的影響正常大鼠隨機分為 METH 5、10、20、40 mg·kg-1和鹽水對照組，各組大鼠預先置于觀測盒中，適應30 min后腹腔注射METH，立即觀測并記錄其行為變化。METH 5 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后5～10 min開始出現豎毛、豎尾，偶有反復的探索和嗅探動作，其他行為改變不明顯;METH 10 mg·kg-1和20 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后2～5 min即出現豎毛、豎尾、搖頭、抬頭和旋轉等刻板行為;40 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后1 min左右即出現明顯的行為變化，繼而出現迅速的旋轉、搖頭等刻板行為，警覺性明顯增強，個別大鼠甚至出現自殘行為。用刻板行為評分表統計，除5 mg·kg-1劑量組大鼠刻板行為評分小于2(1.4±0.24分)，其余3組評分結果分別為(2.8±0.37)分、(3.2±0.2)分和(4.2±0.2)分，均大于2分，且刻板行為評分與劑量呈正相關(Fig 2)。METH 10、20和40 mg·kg-1劑量組刻板行為評分與對照相比差異均有顯著性(P＜0.05);10 mg·kg-1與20 mg·kg-1組相比差異沒有顯著性;40 mg·kg-1劑量組與10和20 mg·kg-1組相比有顯著性差異(P＜0.05)。根據上述試驗結果并參照文獻劑量，在本實驗中選擇20 mg·kg-1為急性處理的最佳劑量。

Fig 2 Effect of METH with different doses on stereotyped behaviors of rats(n=5，±s)

3.2頭孢曲松預防給藥對METH急性處理的影響腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg-1對大鼠行為活動無明顯影響，與鹽水對照組動物的行為表現基本相當，刻板行為評分為(0.9±0.1)分，差異無顯著性;大鼠腹腔注射METH 20 mg·kg-1后5 min內即出現不停的嗅探、搖頭和旋轉等刻板行為，刻板行為評分為(3.7±0.3)分，約為鹽水對照組的3.7倍，與鹽水對照組相比刻板行為評分明顯增加(P＜0.01);Cef+METH組在給METH前30 min給予頭孢曲松(劑量與單藥組相同)，動物也出現不停的嗅探、轉圈等刻板行為，但急速搖頭、倒退和旋轉等重度癥狀減少或持續時間很短，刻板行為評分為(2.5±0.2)分，與METH急性處理組相比，METH+Cef組大鼠刻板行為評分明顯下降(P＜0.01)，約為METH組的67.5%(Fig 3)。

Fig 3 Effect of ceftriaxone on stereotyped behavior of rats induced by METH——acute treated(n=10，xˉ±s)

3.3METH對大鼠紋狀體中Glu、Gly及GABA水平的影響在基礎透析平衡后連續采集3個樣品測定基礎釋放值后，大鼠皮下注射METH 20 mg·kg-1，后繼續測定6 h。METH給藥后胞外谷氨酸水平持續升高，在本實驗檢測時間范圍內，5.5 h時胞外谷氨酸濃度與基礎平衡值相比增加高達450%;經重復測量的two-way ANOVA檢驗，METH急性處理組與鹽水對照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)(Fig 4)。

Fig 4 The effect of METH on Glu releasing in striatum

METH急性處理后與鹽水對照組相比，胞外GABA水平在0～3 h時間內有降低的趨勢，3～6 h內有升高的趨勢;胞外Gly水平變化在不同檢測時間點或不變或升高，沒有一致性。經重復測量的two-way ANOVA檢驗，甲基苯丙胺急性給藥組與鹽水對照組相比差異沒有顯著性(P＞0.05，Fig 5)。

3.4頭孢曲松對METH引起紋狀體中胞外Glu、Gly及GABA水平變化的影響在基礎透析平衡后連續采集3個樣品測定基礎釋放值后，Cef+METH組大鼠在給予METH前30 min腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg-1，后繼續測定6 h。頭孢曲松單藥腹腔注射后，不影響紋狀體中胞外谷氨酸水平。與鹽水對照組相比，紋狀體中胞外谷氨酸水平沒有變化(P＞0.05)。METH急性處理后胞外谷氨酸水平升高，在本實驗檢測時間范圍內，5.5 h時胞外谷氨酸濃度與基礎平衡值相比增加高達4.5倍;預防給予頭孢曲松后，Cef+METH組大鼠紋狀體中胞外谷氨酸水平也升高，但趨勢較緩，峰值較小。經重復測量的three-way ANOVA檢驗，各組間差異有顯著性(P＜0.05)，其中，METH急性處理組與鹽水對照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，Cef+METH組與METH急性處理組相比差異有顯著性(P＜0.05，Fig 6)。

Fig 5 The effects of METH on Gly and GABA releasing in striatum

METH急性處理后，與鹽水對照組相比，胞外GABA水平在0～3 h時間內有降低的趨勢，3～6 h有升高的趨勢;預防給予頭孢曲松后，頭孢曲松單藥腹腔注射后，不影響紋狀體中胞外谷氨酸水平，Cef+METH組與METH組相比在0～3 h時間內有升高的趨勢，3～6 h有降低的趨勢;但經重復測量的three-way ANOVA檢驗，各組間差異沒有顯著性(P＞0.05，Fig 7)。

Fig 6 The effects of ceftriaxone on METH-induced GLU release in striatum

3.5頭孢曲松對METH引起DA及DOPAC水平變化的影響在基礎透析平衡后連續采集3個樣品測定基礎釋放值后，大鼠皮下注射METH 20 mg·kg-1后繼續測定4 h。HPLC統計結果如Fig 8所示，METH給藥后0.5～1 h，胞外DA水平升高，在1 h時胞外DA水平達峰值，與基礎平衡值相比增加高達1248.6%，繼而下降，在4 h時基本恢復至基礎水平;胞外DOPAC水平則持續下降，透析結束時胞外DOPAC水平降至基礎水平的12.4%。Cef+METH組大鼠在給予METH前30 min腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg-1。頭孢曲松預防給藥后，可抑制胞外DA水平升高，在測定時間給藥后1 h胞外DA水平達峰值，與基礎平衡值相比增加高達838.4%，繼而下降，在4 h基本恢復至基礎水平;胞外DOPAC水平也持續下降，透析結束時胞外DOPAC水平降至基礎水平的25.3%(Fig 8)。

4 討論

谷氨酸是中樞神經系統內主要的興奮性神經遞質，對神經系統正常功能的維持起著重要作用。研究表明，METH通過促進DA的異常釋放而增加細胞外谷氨酸濃度進而對神經元產生損傷作用。給予DA受體激動劑苯丙胺誘發的刻板行為與紋狀體中早期快反應基因表達有關，說明刻板行為與紋狀體中神經遞質的改變有關。Presti等［8］采用微透析技術發現，具有刻板行為的鹿鼠紋狀體中谷氨酸和天冬氨酸的胞外濃度增加;METH給藥后伴隨氨基酸能神經傳遞的增加，VTA-NAc通路中DA釋放也受到谷氨酸能神經傳遞的調節，而且NMDA受體拮抗劑能夠在刻板行為、CPP、行為敏化、自身給藥等模型上對抗METH的作用。因此，Glu和GABA等氨基酸類神經遞質顯然參與了METH致神經損傷過程。

Fig 7 The effects of ceftriaxone on METH-induced Gly and GABA release in striatum

本研究中我們采用清醒動物腦微透析技術結合高效液相色譜技術分析了METH急性處理致神經損傷模型上紋狀體中胞外Glu、Gly及GABA及DA水平變化情況。實驗結果發現，METH在給藥后，在測量的不同時間點內，紋狀體中胞外Glu水平持續增加，與實驗過程中發現給予METH后大鼠刻板行為明顯增加相一致，而且與文獻報道結果基本相符［9］。在本實驗檢測時間范圍內，5.5 h胞外谷氨酸濃度與基礎平衡值相比增加高達450%。GABA水平有先降低后增加的趨勢，但差異沒有顯著性。在本實驗中METH急性處理后1 h，紋狀體中DA水平達峰值，后急速降低。至給藥后4 h胞外DA水平恢復基本正常;與文獻報道METH給藥后40 min胞外DA水平達峰值［10］有時間上的不一致性，可能是由于微透析實驗過程中取樣時間間隔不同引起的。

Fig 8 The effects of ceftriaxone on METH-induced DA release in striatum

近來有研究結果證明［11］，利用谷氨酸轉運體調節劑調控谷氨酸轉運體的蛋白表達能有效降低胞外谷氨酸水平，改善神經保護的作用。2005年Nature雜志報道［12］頭孢曲松能夠激活GLT-1的表達和功能活性;頭孢曲松200 mg·kg-1腹腔注射可提高皮層和伏隔核中氨酸轉運體GLT1的蛋白表達，減弱可卡因自身給藥行為、條件性位置偏愛和行為敏化，并且減慢嗎啡軀體依賴進程［13-16］。頭孢曲松預防給藥還可對抗戊四氮誘發的全身性癲癇大發作癥狀，減少其死亡率［17］;并且通過增加GLT1的表達，減小血栓面積，增強腦局部缺血耐受性;在大鼠腦中風模型上通過提高海馬區GLT1蛋白活性，保護神經元，提高其存活率;在HD模型大鼠上通過提高紋狀體中GLT1的表達，減少胞外谷氨酸濃度，緩解HD的握爪、攀爬等一些顯性癥狀。而且頭孢曲松預防給藥和治療給藥，明顯地減慢髓鞘少突膠質細胞誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎的臨床進程［18-21］。

在本實驗中，預防給予頭孢曲松后，紋狀體中胞外谷氨酸水平明顯降低，且在給藥后1.5、2、2.5、3、3.5、4.5、5和 5.5 h時間點胞外谷氨酸濃度與METH組相同時間點濃度相比差異有顯著性，可能是由于頭孢曲松上調谷氨酸轉運體GLT1的蛋白表達，加速胞外谷氨酸的清除，從而抑制谷氨酸引起的興奮性傳遞。GABA水平有先增加后降低的趨勢，但差異沒有顯著性。頭孢曲松預防給藥組和METH急性處理組大鼠的透析液中DA基礎釋放值無差異;而在預防給予頭孢曲松后，紋狀體中DA水平在給藥后1 h達峰值，峰值相對較小，與同時間點METH急性處理組大鼠紋狀體中DA水平相比差異沒有顯著性。

METH急性處理后，胞外谷氨酸水平升高，產生興奮性毒性。預防給予頭孢曲松后，可通過調節谷氨酸轉運體的蛋白表達，及時清除胞外過量谷氨酸，減少突觸前囊泡內谷氨酸的釋放，從而降低胞外谷氨酸水平，減小谷氨酸和DA二者的協同作用，減小興奮性毒性，保護神經元，并且能抑制METH引起的刻板行為。利用藥物調控谷氨酸轉運體的表達，加速胞外谷氨酸的清除，降低胞外谷氨酸水平，從而抑制谷氨酸的興奮性傳遞，為達到干預谷氨酸的興奮性毒性提供可能。

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