星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化白芷的超聲波輔助提取工藝

董自亮， 肖 丹， 何 健， 梅 雪

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137)

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)shan et Yuan的干燥根。其性溫，氣芳香，味辛、微苦，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用，被臨床廣泛應(yīng)用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶和瘡瘍腫痛等癥，并有較好的療效［1］。白芷中總香豆素類為其鎮(zhèn)痛的主要成分，又以歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素為其主要成分，其止痛效果已被充分肯定［2］。

目前國(guó)內(nèi)多采取正交設(shè)計(jì)優(yōu)化藥材的提取工藝，這種方法采用線性數(shù)學(xué)模型，雖有簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，但精度不太高。星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)［3-5］是近幾年來國(guó)外藥學(xué)工作者常用的集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)方法于一體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，多采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)高，應(yīng)用已經(jīng)成熟，具有精度高、預(yù)測(cè)性好、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。近年國(guó)內(nèi)也有其用于優(yōu)化處方或成型工藝的報(bào)道［6-9］。本實(shí)驗(yàn)引入星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選白芷的提取工藝，旨在優(yōu)化白芷提取工藝的同時(shí)，為探討該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法應(yīng)用于優(yōu)化傳統(tǒng)中藥提取工藝可行性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

KQ-300E型超聲波清洗器(超聲頻率:40 KHz;超聲功率:300 W;昆山市超聲儀器有限公司);島津LC-2010 AHT型高效液相色譜儀，島津Class vp色譜工作站;電子天平(BP-211D，Sartorius，德國(guó))。

白芷藥材于2009年3月采自四川遂寧，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬逾英教授鑒定為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f的干燥根，符合《中國(guó)藥典》2010版一部白芷項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，陰干，粉碎，備用;歐前胡素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):110826-200712);所用水為純蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 歐前胡素定量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為 Dikama C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):300 nm;流動(dòng)相:甲醇-水(70∶30);體積流量:1 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對(duì)照品5.15 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取白芷提取液5 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取10 μL不同質(zhì)量濃度(5.150、7.725、10.300、12.875、15.450、18.025 μg/mL)的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得線性方程為Y=49 068X－1 443.3，(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，歐前胡素對(duì)照品溶液在5.150 ～18.025 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果歐前胡素峰面積的RSD為1.70%。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一對(duì)照品溶液，分別在 0、2、4、6、8 h 測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定，得出RSD為1.62%，表明被測(cè)物在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 同一批號(hào)白芷藥材按照2.1.3項(xiàng)下方法平行制備5份，測(cè)定RSD為1.91%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取同一白芷藥材粉末約0.2 g(約含有歐前胡素0.42 mg)9份，分成高、中、低3組，精密加入對(duì)照品適量，按照2.1.3項(xiàng)下平行制備供試品溶液，計(jì)算得平均回收率為101.86%，RSD 為 2.35%。

2.1.9 藥材含量測(cè)定 取白芷樣品，平行制備3份供試品，分別吸取10 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得白芷藥材中歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21%(n=3)，色譜圖見圖1。

圖1 歐前胡素對(duì)照品(A)與白芷提取液(B)的HPLC圖

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn) 白芷超聲提取工藝的考察因素為乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、功率等，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際，暫定超聲功率為300 W，其余因素的水平據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果而定。因素水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.3 模型擬合 以白芷歐前胡素的提取率為因變量對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，使用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件，擬合模型如下:

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

多元線性回歸:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3，

多元線性回歸:r=0.900 8，F(xiàn)=15.78，P=0.000 3＜0.01，盡管模型通過檢驗(yàn)，但擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差，因此線性模型不合適。故對(duì)其二項(xiàng)式進(jìn)行擬合，對(duì)各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，刪除P＞0.05的項(xiàng)，以達(dá)到簡(jiǎn)化模型的目的，結(jié)果見表3。

模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.988 6，先刪除最不可信的b7項(xiàng)，重新擬合，再根據(jù)P值依次刪除b8、b5項(xiàng)，再擬合，結(jié)果見表4。

復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.973 8，相對(duì)于線性擬合有大幅提高，方程簡(jiǎn)化后r值降幅很小，表明該方程有較大的可信度。

表3 二項(xiàng)式非線性估計(jì)結(jié)果

表4 簡(jiǎn)化后二項(xiàng)式非線性估計(jì)結(jié)果

2.4 工藝優(yōu)化和預(yù)測(cè) 因變量曲面圖是三維圖，只能表達(dá)含兩個(gè)自變量的函數(shù)，因此固定三個(gè)自變量之一為中值，以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Origin 7.5軟件繪制因變量曲面圖(見圖2～4)，在圖上選取提取率高的較佳工藝范圍:X1:70%～80%;X2:65～75 min;X3:12～14倍;結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)，故本實(shí)驗(yàn)選取白芷超聲提取的最佳工藝為12倍量、75%乙醇提取70 min。

圖2 乙醇質(zhì)量濃度和提取時(shí)間對(duì)指標(biāo)值歐前胡素的效應(yīng)面圖

圖3 乙醇質(zhì)量濃度和料液比對(duì)指標(biāo)值歐前胡素的效應(yīng)面圖

圖4 提取時(shí)間和料液比對(duì)指標(biāo)值歐前胡素的效應(yīng)面圖

根據(jù)較佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果與擬合方程預(yù)測(cè)值相比較，偏差為2.16%，見表5。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

國(guó)內(nèi)關(guān)于白芷超聲提取工藝的文獻(xiàn)少有報(bào)道，作者以歐前胡素為考察指標(biāo)，優(yōu)化了白芷超聲提取工藝，同時(shí)改進(jìn)了2010年版《中國(guó)藥典》中白芷含量測(cè)定的色譜條件，結(jié)果表明本HPLC結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高、重現(xiàn)性好。

本課題組也對(duì)影響正交試驗(yàn)的因素乙醇濃度、料液比以及提取時(shí)間不同水平進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到的正交設(shè)計(jì)的結(jié)果是加入14倍量的75%乙醇，提取75 min，3次驗(yàn)證后可得平均提取率為88.64%。由兩者優(yōu)化的結(jié)果可知:所用的乙醇濃度相等，兩者的提取率無(wú)顯著性差異，但是星點(diǎn)設(shè)計(jì)中溶劑用量較正交設(shè)計(jì)少，所用提取時(shí)間短于正交設(shè)計(jì)，考查因素的水平范圍更大，最優(yōu)工藝的選擇不僅限于所設(shè)置的水平;由試驗(yàn)結(jié)果可知，星點(diǎn)設(shè)計(jì)的理論優(yōu)化結(jié)果與試驗(yàn)值相差不大，由此可以看出采用非線性模型，更接近客觀實(shí)際和便于找到極值范圍，水平的選取更為直觀，實(shí)驗(yàn)精度更高，預(yù)測(cè)性更好。

提取次數(shù)是影響白芷提取工藝的因素之一，由于提取次數(shù)為不連續(xù)變量，故前期未對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行考察。后期經(jīng)過進(jìn)一步試驗(yàn)考察與驗(yàn)證，按本工藝條件對(duì)白芷藥材進(jìn)行超聲提取2次后，歐前胡素已基本提取完全，故確定最佳優(yōu)化工藝為:以12倍量、75%乙醇超聲提取2次，每次70 min。

致謝:研究得到通威股份有限公司藥物研究所的幫助。

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