氧化苦參堿在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征

劉 蘇， 秦 晶， 陸偉根， 李永吉

(1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203;2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥物制劑國(guó)家工程研究中心，上海 200437;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

氧化苦參堿(oxymatrine，OM)是從豆科植物苦豆草Sophoro alopecuroidesL的種子苦豆子或豆科植物苦參SophoroflavescensAit的根中提取的一種苦參型生物堿。OM藥理作用廣泛，具有抗病毒、強(qiáng)心、降壓、抗炎、殺菌、抗腫瘤等作用，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景［1－3］。目前OM在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于慢性乙型病毒性肝炎的治療，并取得了一定的療效［4－8］。關(guān)于OM體內(nèi)外研究的報(bào)道較多，但對(duì)于其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究相關(guān)報(bào)道較少。本研究采用HPLC法考察OM在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，為OM臨床制劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試藥 氧化苦參堿對(duì)照品，內(nèi)標(biāo)西咪替丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):氧化苦參堿110780－200506;西咪替丁 100158－200204);OM 原料藥(江蘇天晟藥業(yè)有限公司，純度＞98%);乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia公司);其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠 由上海市西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，體質(zhì)量(200±30)g。

1.3 儀器 Waters高效液相色譜儀(Waters 2487檢測(cè)器，Waters515泵);XW－80型漩渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠);臺(tái)式離心機(jī)TGL－16G(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥方案 大鼠12只隨機(jī)分為兩組，稱質(zhì)量后分別為給予尾靜脈注射25 mg/kg(OM以超純水溶解制成6 mg/mL的溶液)及灌胃125 mg/kg(OM以超純水溶解制成30 mg/mL的溶液)。給藥前禁食12 h，自由飲水。給藥后4 h內(nèi)禁食。

2.2 血漿樣品采集與處理［4］靜注后于0.033、0.133、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8 h，灌胃后于 0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12 h 眼眶取血0.5 mL置于含肝素的離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿0.2 mL轉(zhuǎn)移至具塞離心管中，精密加入0.02 mg/mL內(nèi)標(biāo)西咪替丁溶液20 μL，6%(w/v)HCIO40.4 mL，旋渦混合 30 s，3 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加 20%NaOH 溶液 0.4 mL，三氯甲烷－正丁醇(98 ∶2，v/v)提取溶液 3 mL，旋渦混合 3 min，4 000 r/min離心10 min，吸取有機(jī)相，60℃水浴氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL流動(dòng)相溶解，旋渦混合30 s，離心(10 000 r/min)5 min。取上清液備用。

2.3 色譜條件 采用C18柱(Discovery?，150 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫 30 ℃，流動(dòng)相 0.1 mol/L KH2PO4水溶液－乙腈(93 ∶7)，H3PO4調(diào) pH 2.5，體積流量1 mL/min。取2.2項(xiàng)下樣品20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，上述條件下，主峰與雜質(zhì)分離效果良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，OM和內(nèi)標(biāo)西咪替丁的保留時(shí)間分別約為12.19、14.34 min。

圖1 氧化苦參堿在大鼠體內(nèi)HPLC圖譜A.大鼠空白血漿+內(nèi)標(biāo)西咪替丁 B.大鼠血漿+OM+內(nèi)標(biāo)Fig.1 Chromatograms of OM in rat plasmaA.plasma sample with internal standard B.blank plasma with OM and internal standard

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取具塞離心管，精密吸取不同濃度的OM對(duì)照品溶液適量，各加入大鼠血漿0.2 mL，分別配制成 OM 質(zhì)量濃度為 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL 的血漿樣品;按 2.3 項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以血藥濃度為縱坐標(biāo)，樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，并采用權(quán)重系數(shù)法進(jìn)行校正，得回歸方程:A=3.896 7C+1.429 7，r=0.999 2，符合方法學(xué)要求。

2.5 方法回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取大鼠空白血漿200 μL分別置于具塞離心管中，配制成質(zhì)量濃度為0.05、10、100 μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，按2.2項(xiàng)下處理后，按2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，記錄峰面積比值，求得血漿樣品質(zhì)量濃度并計(jì)算方法回收率。結(jié)果高、中、低質(zhì)量濃度方法回收率分別為 88.67%、95.41%、93.56%，符合方法學(xué)要求。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制0.1、5、100 μg/mL高中低3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，按2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，分別于1 d內(nèi)連續(xù)5次及連續(xù)5 d內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，求得日內(nèi) RSD分別為:3.4%、5.2%、3.6%及日間 RSD 分別為:4.3%、2.8%、3.7%。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取已知低、中、高3種質(zhì)量濃度(0.05、5、50 μg/mL)的 OM 血漿樣品數(shù)份，分別置 4℃、－20℃條件下存放96 h，按2.2項(xiàng)下處理后進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算藥物含量。結(jié)果OM樣品含量變化分別為2.4%和4.3%，表明OM血漿樣品在上述兩個(gè)條件下96 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算 大鼠口服及靜注OM后的血藥濃度隨時(shí)間變化的曲線，如圖2。以Kinetica程序?qū)?只SD大鼠口服及靜注的血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)時(shí)擬合計(jì)算其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖2 OM給予大鼠后經(jīng)時(shí)平均血藥濃度曲線(n=6)A.靜注(25 mg/kg)B.灌胃(125 mg/kg)Fig.2 Mean plasma concentration-time curve after IG and IV administration of OM to rats.(n=6)A.IV(25 mg/kg)B.IG(125 mg/kg)

表1 口服及靜注后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (n=6)Tab.1 Pharmacokinetic parameters after IV and IG administration to rats (n=6)

絕對(duì)生物利用度采用下列公式計(jì)算:

經(jīng)計(jì)算，絕對(duì)生物利用度為9.31%。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)研究了OM的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征，結(jié)果表明OM體內(nèi)半衰期較短，生物利用度較低，考慮其原因主要是由于氧化苦參堿水溶性較強(qiáng)，難以透過(guò)生物膜，本研究為制劑研究提供了參考，因此在制劑研究中可以考慮提高其脂溶性或制備成緩釋制劑以提高氧化苦參堿的生物利用度。

3.2 OM的紫外吸收官能團(tuán)較弱，因此進(jìn)行HPLC檢測(cè)時(shí)效果會(huì)受到一定的影響。本文建立的HPLC方法經(jīng)過(guò)了多次對(duì)流動(dòng)相的篩選，最終確定采用磷酸鹽緩沖體系做為流動(dòng)相，分離效果良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，且有較好的重現(xiàn)性和專屬性，適用于OM血藥濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

3.3 本實(shí)驗(yàn)在選擇血漿樣品處理方法時(shí)，文獻(xiàn)多采用蛋白沉淀法［9－10］。本研究分別考察了直接蛋白沉淀法和萃取法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接蛋白沉淀法沉淀不完全，干擾較大。因此在沉淀蛋白的基礎(chǔ)上結(jié)合有機(jī)溶劑萃，并采用不同濃度的NaOH堿化，結(jié)果20%NaOH堿化后結(jié)合有機(jī)溶劑萃取的方法可排除干擾，獲得了滿意的效果。

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