膠束電動毛細管色譜法同時測定感冒軟膠囊中4種活性成分

霍 鵬， 黃麗涵， 朱平川， 徐遠金*

（1.廣西大學廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西南寧530004；2.廣西大學化學化工學院，廣西南寧 530004）

膠束電動毛細管色譜法同時測定感冒軟膠囊中4種活性成分

霍 鵬1，2， 黃麗涵1， 朱平川1， 徐遠金1，2*

（1.廣西大學廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西南寧530004；2.廣西大學化學化工學院，廣西南寧 530004）

目的 建立中藥復方制劑感冒軟膠囊（羌活、麻黃、桂枝、葛根、黃芩、川芎、防風等）中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素及黃芩苷4種活性成分同時測定的膠束電動毛細管色譜法。方法 以甲醇提取樣品，電泳緩沖液為10 mmol/L磷酸氫二鈉-20 mmol/L硼酸（pH 8.0），內含20 mmol/L十二烷基硫酸鈉（SDS）及體積分數分別為27%（v/v）異丙醇和18%（v/v）乙腈作有機改性劑，采用75 μm（i.d）×60（ef 50）cm的未涂層彈性石英毛細管柱，0.5 psi（進樣時間6 s）壓力進樣，分離電壓30 kV，紫外檢測波長214 nm，溫度25℃。結果 4種活性成分在23 min內獲得基線分離，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的線性范圍分別為 1.5 ～200 μg/mL（r=0.999 4）、2.4 ～150 μg/mL（r=0.999 8）、1.8 ～120 μg/mL（r=0.999 1），4.5 ～300 μg/mL（r=0.999 1），檢出限分別為 0.50、0.80、0.60、1.5 μg/mL（S/N=3）。樣品加標回收率在91.0% ～109%之間，相對標準偏差均小于3.2%。結論 本法簡便、快速，具良好的精密度和回收率，已成功用于實際樣品的分析。

膠束電動毛細管色譜；感冒軟膠囊；鹽酸麻黃堿；鹽酸偽麻黃堿；葛根素；黃芩苷

感冒軟膠囊為常用中成藥，由羌活、麻黃、桂枝、葛根、黃芩、川芎、防風等十四味中藥材經提取等工藝制成，具有散風解熱之功效，用于外感風寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節酸痛、咽喉腫痛等癥，質量標準收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第六冊［1］。其中麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，葛根中葛根素及黃芩中黃芩苷為感冒軟膠囊中的活性成分。文獻報道了HPLC測定感冒軟膠囊中葛根素［2-3］、黃芩苷［4-5］和用薄層色譜法測定該藥中鹽酸麻黃堿［6］，采用毛細管電泳法測定鹽酸麻黃堿 和 鹽 酸 偽 麻 黃堿［7］、葛根 素［8-9］或 黃 芩苷［10-12］亦有報道，韓杰等［13］也采用 HPLC 法測定了感冒軟膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、黃芩苷4種活性成分，但因生物堿類和黃酮類的色譜行為差別較大而未能實現在同一流動相下進行4種成分的同時分離檢測。為此，本實驗建立了膠束電動毛細管色譜法同時測定感冒軟膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、黃芩苷4種活性成分的分析方法。方法準確，操作方便，可用于該制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

P/ACETMMDQ毛細管電泳儀帶二極管陣列檢測器（美國Beckman公司）；未涂層彈性石英毛細管（75 μm×60 cm，有效長度50 cm）（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；Orion 720A型酸度計/離子計（美國Thermo公司）；Synthesis A10TM超純水系統（美國Millipore公司）；ME 215S電子天平（德國Sartorius公司）。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所；感冒軟膠囊（洛陽君山制藥有限公司，批號：091202、100201）；甲醇、異丙醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 電泳條件 以20 mmol/L SDS-10 mmol/L磷酸氫二鈉-20 mmol/L硼酸（pH=8.0），內含體積分數分別為27%（v/v）異丙醇和18%（v/v）乙腈為電泳緩沖液，未涂層彈性石英毛細管（75 μm×60 cm）為分離通道，壓力進樣（0.5 psi×6 s），分離電壓30 kV，分離溫度25℃，檢測波長214 nm。所有溶液在使用前均用0.45 μm濾膜過濾，并超聲脫氣。毛細管每天使用前，分別用0.1 mol/LNaOH、超純水和緩沖液各沖洗10 min。

2.2 對照品溶液的配制 取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷對照品各約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.00 mg/mL的對照品貯備液，密封于4℃下冰箱中保存，實驗時用80%甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 樣品溶液的配制 取數粒膠囊樣品的內容物，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇超聲提取60 min后，取出，放冷，以4 000 r/min，－4℃離心15 min，吸出上清液至25 mL量瓶中，殘渣用甲醇洗滌后重新提取一次，合并上層清液，用甲醇定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.4 線性關系與檢出限 取各對照品貯備液，分別配制成不同質量濃度的系列混合溶液，于優化后的條件下分別進樣測定，重復3次，以峰面積平均值（Y）對對照品混合液中4種活性成分的質量濃度（X，μg/mL）進行回歸分析，得到回歸方程、相關系數和線性范圍，以信噪比等于3為標準，測得4種活性成分的檢出限。結果見表1。

表1 4種成分的線性關系及檢出限Tab.1 Regression equation and detection limit of four compounds

2.5 精密度試驗 取同一感冒軟膠囊樣品溶液，按2.3項下方法制備，重復進樣測定5次，記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的峰面積，得RSD 分別為 1.7%、2.3%、0.43%、0.17%。

2.6 穩定性試驗 取同一批次樣品，按2.3項下方法制備樣品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h 時進樣測定，結果RSD均小于1.4%，表明樣品溶液在8 h內穩定，結果見表2。

表2 穩定性試驗Tab.2 Stability test

2.7 重復性試驗 取同批樣品5份，按2.3項下方法制備，進樣測定，測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的平均質量分數分別為1.14 mg/g、0.559 mg/g、0.467 mg/g、0.651 mg/g，RSD 分別為 1.9%、1.5%、1.3%、2.0%，表明分析方法的重復性良好。

2.8 加標回收率試驗 取已測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的同批樣品共9份，3份為一組，按低、中、高3個質量濃度分別加入對照品溶液，按2.3項下方法制備，進樣測定，計算4種活性成分的平均回收率和RSD，結果見表3。

2.9 樣品測定 分別精密吸取不同批號樣品各5份，按2.3項下方法制備樣品溶液，分別進樣測定，代入回歸方程計算得到樣品中4種活性成分質量分數，結果見表4。對照品及樣品的電泳譜圖見圖1。

表3 樣品加標回收率（n=3）Tab.3 Recoveries of four compounds in samples（n=3）

表4 樣品測定結果（n=5）Tab.4 Results of sample analysis（n=5）

圖1 對照品（A）及樣品（B）的電泳譜圖Fig.1 The electropherograms of standard（A）and sample（B）

3 討論

3.1 電泳分離條件的優化

3.1.1 緩沖溶液中磷酸鹽質量濃度對分離的影響實驗考察了Na2HPO4質量濃度在5～25 mmol/L范圍內對分離的影響，質量濃度較小時，譜峰變寬，遷移時間短，當Na2HPO4質量濃度低于5 mmol/L時，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿分離度很小，未達基線分離。當質量濃度較大時，減弱了溶質間的相互作用，降低了樣品擴散，使譜峰變窄，分離度增大，遷移時間增加，當 Na2HPO4質量濃度高于25 mmol/L時，各峰的遷移時間較長，基線噪音增加。當Na2HPO4質量濃度為10 mmol/L時，各物質間分離度最好，遷移時間也相對較短。

3.1.2 SDS質量濃度對分離的影響 在緩沖溶液中加入SDS，可使譜峰變窄，改善分離度，在膠束電動毛細管色譜模式下比在毛細管區帶電泳模式下分離效果更好。實驗結果表明，SDS質量濃度太低時，各成分間無法分離。隨著SDS質量濃度增加，分析物和膠束體結合的機會增多，從而延長了遷移時間，同時也增加了分離度。綜合考慮分離度和遷移時間，選擇SDS的質量濃度為20 mmol/L。

3.1.3 緩沖溶液中硼酸質量濃度對分離的影響 實驗考察了硼酸質量濃度在5～25 mmol/L范圍內對各峰分離度的影響，硼酸質量濃度過低或過高時都會降低鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿兩峰之間的分離度，且4種成分的峰形也會隨之變差。經反復考察，選擇硼酸質量濃度為20 mmol/L。

3.1.4 緩沖溶液pH值對分離的影響 實驗考察了pH從6到10范圍內變化對各峰的影響，當pH小于6時，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿不能實現完全分離，pH大于10后，各成分峰形變差，且遷移時間隨pH值的升高而延長。實驗證明當pH=8.0時最佳，4種活性成分都已達到基線分離。

3.1.5 有機改性劑的種類和質量分數對分離的影響 有機改性劑可通過改變緩沖體系中水相的特性，影響SDS膠束的結構，增加分析物的溶解度而提高分離度。待測成分為疏水性質，加入有機改性劑，可防止其沉淀析出，使測定順利進行。我們考察了不同質量分數的乙腈和異丙醇（均為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）對4種活性成分遷移時間和分離度的影響。發現，當緩沖液中只含一種有機改性劑時，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿完全重疊。隨著乙腈和異丙醇質量分數的增加，遷移時間逐漸延長，分離度逐漸增大，當緩沖溶液中乙腈質量分數為18%、異丙醇質量分數為27%時，4種活性成分可獲得較好的分離度，靈敏度高。

3.2 分離電壓對分離的影響 考察了15～30 kV范圍內分離電壓對結果的影響。隨著分離電壓的升高，電滲流速度加快，樣品的遷移時間明顯縮短，峰形尖銳。當分離電壓達到30 kV時，4種活性成分能得到快速而有效的分離，未存在重現性差的問題。因此，選擇分離電壓為30 kV。

3.3 進樣時間對分離的影響 固定0.5 psi的壓力進樣，在6～12 s范圍內改變進樣時間。發現進樣時間越長，靈敏度越高。但隨著進樣量的增大，分離度下降，峰形變差。綜合考慮，選擇進樣時間為6 s。

［1］中華人民共和國衛生部.衛生部藥品標準·中藥成方制劑：第6冊［S］.1992：193.

［2］王月敏，夏素霞，王淑清.HPLC法測定感冒軟膠囊中葛根素的含量［J］.中國中醫藥雜志，2005，3（11）：1011-1012.

［3］沙東旭，段 瑞，陳 越.高效液相色譜法測定感冒軟膠囊中葛根素的含量［J］.中醫藥學刊，2005，23（6）：1117-1118.

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Simultaneous determination of four effective components in Ganmao Soft Capsule by micellar electrokinetic capillary chromatography

HUO Peng1，2， HUANG Li-han1， ZHU Ping-chuan1， XU Yuan-jin1，2*
（1.Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresource Conservation and Utilization，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

AIMTo establish a new method for simultaneously determing the contents of ephedrine hydrochloride，pseudoephedrine hydrochloride，puerarin and baicalin in Ganmao Soft Capsule（Notopterygii Rhizoma et Radix，Ephedrae Herba，Cinnamomi Ramulus，Puerariae Lobatae Radix，Scutellariae Radix，Chuanxiong Rhizoma，Saposhnikoviae Radix，etc.）by micellar electrokinetic capillary chromatography（MECC）.METHODSThe samples in preparation were extracted by methanol，20 mmol/L SDS-10 mmol/L Na2HPO4-20 mmol/L H3BO3mixture（containing 27%2-Propanol and 18%acetonitrile，pH=8.0）was selected for the running buffer.The four effective components were separated by an uncoated fused silica capillary（75 μm ×60 cm）with the detection wavelength of 214 nm，voltage of 30 kV and temperature of 25℃.RESULTSThe baseline separation of four components was achieved within 23 min.The linear ranges were 1.5-200 μg/mL，2.4-150 μg/mL，1.8-120 μg/mL，4.5-300 μg/mL for ephedrine hydrochloride，pseudoephedrine hydrochloride，puerarin and baicalin with detection limits of 0.50，0.80，0.60，1.5 μg/mL，respectively.The average recoveries of the four components were between 91.0% －109%with all relative standard deviations less than 3.2%.CONCLUSIONThe method is simple，rapid with excellent precision and high recovery and can be used for the quality control of Ganmao Soft Capsules.

micellar electrokinetic capillary chromatography（MECC）；Ganmao Soft Capsule；ephedrine hydrochloride；pseudoephedrine hydrochloride；puerarin；baicalin

R927.2

A

1001-1528（2011）07-1190-04

2010-12-14

廣西自然科學基金資助項目（桂科自0832034）

霍 鵬（1984—），女，碩士生，從事色譜、質譜及其聯用方法的研究。E-mail：haip0716@163.com

* 通信作者：徐遠金，博士，教授。Tel：（0771）3237743，E-mail：yjxu@gxu.edu.cn