靈仙新苷微乳的制備及其初步藥效學研究

董彩霞， 李默影， 姚 嵐， 李豐文， 李運曼， 劉麗芳*

（1.中國藥科大學中藥分析教研室，江蘇南京211198；2.中國藥科大學藥理學教研室，江蘇南京 210009）

靈仙新苷微乳的制備及其初步藥效學研究

董彩霞1， 李默影1， 姚 嵐1， 李豐文1， 李運曼2， 劉麗芳1*

（1.中國藥科大學中藥分析教研室，江蘇南京211198；2.中國藥科大學藥理學教研室，江蘇南京 210009）

目的 制備均一穩(wěn)定的靈仙新苷（clematichinenoside，AR）油包水微乳，并初步考察其對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的治療作用，為威靈仙中藥單體藥物制劑的開發(fā)提供藥效學基礎。方法 選用卵磷脂和乙醇分別作為表面活性劑和助表面活性劑，油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944Cs）作為油相，AR水溶液為水相，繪制偽三元相圖以確定各成分質(zhì)量比。通過在小鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（CFA）制備佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型。以體質(zhì)量、腫脹率、胸腺與脾臟指數(shù)為主要檢測指標，并觀察小鼠病變部位的組織形態(tài)來比較AR微乳與AR溶液及陽性對照藥白芍總苷的差異。結(jié)果 確定Km=1∶1，處方組成為油相50%，混合表面活性劑35%，水相15%，得到AR微乳為澄清的淡黃色溶液，平均粒徑為10.7 nm。AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠療效略好于AR溶液，且AR微乳能更好地改善佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的病理形態(tài)及病變部位的組織形態(tài)。結(jié)論 AR皂苷微乳粒徑較小，脂溶性強，能夠增加藥物在體內(nèi)的生物利用度。這表明微乳作為新的藥物劑型具有廣泛的應用前景。另一方面由于制劑促進藥物吸收的機制并不是單一的，仍需進一步研究。

靈仙新苷；油包水微乳；藥效學

中藥威靈仙來源于毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根及根莖。具祛風濕、通經(jīng)絡、止痛等功效［1］。靈仙新苷（clematichinenoside，AR）是威靈仙的皂苷提取物，具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用［2］。但因其相對分子質(zhì)量較大［3］，水溶性較好，不易通過細胞膜，從而影響其在生物體內(nèi)的吸收利用。

微乳（microemulsion，ME）是由油相、水相、表面活性劑及助表面活性劑四元體系自發(fā)形成的系統(tǒng)，具有外觀透明、各向同性、黏度低及熱力學性質(zhì)穩(wěn)定等特點。油包水型（W/O）微乳作為口服藥物載體具有以下優(yōu)點：可延長水溶性藥物的釋放時間而起到緩釋作用；促進藥物的吸收，避免首關效應，可提高藥物的生物利用度［4］。

本研究采用偽三元相圖法將AR制成油包水（W/O）微乳，并初步考察了AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的治療作用，為AR乳劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

AUY120型電子分析天平（日本shimadzu公司），微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器公司），WZS-1型阿貝折光儀（上海儀器廠），DV-II+Pro Brookfield粘度計（美國博力飛），粒徑分析儀（美國Beckman Coulter N4 plus），Agilent1200液相色譜儀，Diamonsil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm，美國迪馬公司），足跖容積測量器皿（中國藥科大學自制）。

1.2 藥物與試劑

靈仙新苷（AR），由本實驗室提取純化，純度大于90%；卵磷脂（國藥集團化學試劑有限公司）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944Cs，法國佳法賽公司）白芍總苷膠囊（TGP，寧波立華制藥有限公司產(chǎn)品，批號：061201），規(guī)格：0.3 g/粒（含芍藥總苷不少于104 mg）；弗氏完全佐劑（Freund＇s complete adjuvant，sigma公司，批號：058K8702），乙醇為分析純。

1.3 動物

清潔級小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雄性，共48只，由揚州大學醫(yī)學中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001。

2 方法

2.1 微乳偽三元相圖的繪制

精密稱取卵磷脂和乙醇按一定比例混合均勻（表面活性劑/助表面活性劑=Km），即為混合表面活性劑，再與油相（油酸聚乙二醇甘油酯，Labrafil M 1944Cs）按不同比例（1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6∶4，7∶3，8 ∶2，9 ∶1）渦旋混合均勻，向混合液中緩慢滴加蒸餾水并不斷振搖使體系充分混勻，當體系由澄清透明變渾濁時為臨界點，記錄臨界點時加入的水量，按油，水，混合表面活性劑在臨界點的各自質(zhì)量百分數(shù)（w/w）繪制偽三元相圖，確定微乳區(qū)。

考察不同的Km值對微乳形成區(qū)域的影響，在此基礎上固定Km值，考察不同的AR水溶液對微乳形成難易的影響。

2.2 AR微乳的制備

取Labrafil M 1944Cs與AR水溶液充分混合，再滴加處方量的混合表面活性劑，渦旋混合均勻，即得到靈仙新苷（AR）油包水微乳。

2.3 微乳測定

定量吸取所制AR微乳，加入甲醇搖勻破乳后定容，參照文獻［3］，按外標兩點法定量分析單位體積微乳中AR的量。

2.4 微乳理化性質(zhì)測定

黏度測定：取8～10 mL，加入黏度計圓筒中，連接轉(zhuǎn)子開始測定。

折光率測定：按中國藥典2010版規(guī)定方法，恒溫20℃測定微乳的折光率。

粒徑測定：W/O微乳外相為非水介質(zhì)，因此將黏度和折光率作為粒度分析儀的設定參數(shù)后測定。

穩(wěn)定性：取微乳5 000 r/min離心30 min。

類型鑒別：用染色法［5］來鑒定，即根據(jù)紅色的油溶性染料蘇丹紅和藍色的水溶性染料亞甲基蘭在微乳中的擴散快慢來進行判定微乳類型。

2.5 AR微乳初步藥效學研究

取清潔級小鼠48只，按體質(zhì)量隨機分為6組，每組8只，分別為：模型組，AR微乳高劑量組（32 mg/kg），AR微乳中劑量組（16 mg/kg），AR微乳低劑量組（8 mg/kg），白芍總苷組（360 mg/kg），AR水溶液組（32 mg/kg）。于致炎前分別測量每只小鼠體質(zhì)量與足爪容積。測小鼠的足爪容積時用足跖容積測量器皿。右后足跖底部皮內(nèi)注射0.1 mL完全弗氏佐劑致炎［6］。致炎18 h后，各組采用灌胃的方法給予相應劑量的藥物7 d，給藥體積為0.2 mL/10 g，每天一次。

給藥前，給藥第1天，第4天和第7天分別測量各組小鼠的體質(zhì)量，每天用玻璃容積法測小鼠致炎的右后足足跖容積，計算其腫脹率（%）。最后一次給藥24 h后將小鼠處死，切下右足做病理切片，剝離胸腺與脾臟，電子天平稱定質(zhì)量，以平均每100 g體質(zhì)量的臟器質(zhì)量作為指標表示臟器指數(shù)［7］。

腫脹率=（致炎后足跖容積—致炎前足跖容積）/致炎前足跖容積×100%

3 結(jié)果

3.1 Km值及AR水溶液濃度對微乳形成的影響

選用Km 分別為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、1.5 ∶1、2 ∶1，AR水溶液質(zhì)量濃度為150 mg/mL。相圖中左上側(cè)為微乳區(qū)（標記為ME）。如圖1。

固定Km=1，選用空白水溶液與AR水溶液濃度分別為150 mg/mL、300 mg/mL、450 mg/mL繪制偽三元相圖，結(jié)果見圖2。

圖1 Km值對微乳形成區(qū)域的影響Fig.1 Effect of Km to the microemulsion region

圖2 AR濃度對微乳形成區(qū)域的影響Fig.2 Effect of the concentration of AR to the microemulsion region

由圖1可見，在含藥微乳中，隨Km值由1/3到1/1，微乳形成區(qū)域逐漸增大，之后隨著Km值的增加，微乳形成區(qū)域面積有減小的趨勢，故確定Km=1；由圖2可以看出，當Km=1時，含藥微乳相圖中的微乳形成區(qū)域隨AR水溶液濃度增加而增大，均大于空白微乳，這可能與AR作為皂苷類成分具有一定的表面活性有關。當處方組成為：油相50%，混合表面活性劑35%，水相15%時，可形成外觀均一，淡黃色澄清透明溶液。外標兩點法測得高、中、低AR微乳的質(zhì)量濃度分別為：2.08、1.09、0.55 mg/mL。

3.2 微乳理化性質(zhì)

空白微乳與載藥微乳的黏度分別為76 cp和76.2 cp；折光率為 1.439 0 和 1.434 8；平均粒徑為10.7 nm和6.9 nm，經(jīng)離心后各體系仍澄清透明，無分層現(xiàn)象。染色結(jié)果顯示，蘇丹紅在微乳中的擴散速度明顯快于亞甲基蘭，可以判定為W/O型微乳。

3.3 AR微乳藥效學研究結(jié)果

3.3.1 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠體質(zhì)量的影響 在給藥過程中，5組小鼠的體質(zhì)量呈上升的趨勢，且AR微乳高，中，低劑量組，AR溶液組，白芍總苷組小鼠體質(zhì)量與模型組相比均沒有顯著性差異，說明AR微乳、AR溶液、白芍總苷對發(fā)病小鼠的體質(zhì)量無影響。

圖3 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of AR microemulsion on weight of primary AA mice

3.3.2 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠足跖腫脹率的影響 在注射弗氏完全佐劑后，小鼠足跖腫脹率較注射前顯著升高，表明AA小鼠原發(fā)病變模型建立成功。RA病理表現(xiàn)復雜多樣，以關節(jié)的炎性腫脹、變形、滑膜增生、骨及軟骨破壞為主［8］。因此，測量足跖腫脹度是本實驗中判斷AR藥效學的重要依據(jù)。模型組在這7 d內(nèi)足跖腫脹率呈上升的趨勢，給藥7 d內(nèi)，這5種藥物對小鼠足跖腫脹率無顯著性差異，但是AR微乳高，中，低劑量及AR水溶液均能降低小鼠足跖腫脹率。

圖4 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠足跖腫脹率的影響Fig.4 Effect of AR microemulsion on swollen ratio of primary AA mice與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

3.3.3 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎小鼠原發(fā)病變臟器指數(shù)的影響 AR微乳組、溶液組、白芍總苷組均不會引起小鼠胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)的變化，說明AR溶液與微乳均不會引起胸腺和脾臟的萎縮。

圖5 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎小鼠原發(fā)病變臟器指數(shù)的影響Fig.5 Effect of AR microemulsion on organ index of primary AA mice

3.3.4 AR微乳對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠組織形態(tài)學的影響 從病理學測定結(jié)果也表明，5種藥物組小鼠病變部位的組織形態(tài)好于模型組，說明這5種藥物對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的關節(jié)有保護作用。AR微乳給藥高劑量組形態(tài)與白芍總苷組較接近，改善佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變的程度為最好。而AR溶液組仍可見較多炎細胞浸潤，說明在同等濃度下，AR微乳的效果較好。

圖6 病理切片圖Fig.6 Pathological picture15

4 討論

卵磷脂具有良好的生物相容性和乳化能力，以卵磷脂/乙醇作為混合表面活性劑可與多種油相形成穩(wěn)定的油包水微乳［9-11］，靈仙新苷（AR）作為皂苷類成分，具有一定的表面活性，其加入后提高了W/O微乳的形成區(qū)域，可以形成更高載藥量的微乳。在偽三元相圖中，Km=1∶1時微乳區(qū)域最大，可能由于Km＞1∶1時隨著系統(tǒng)中卵磷脂量升高液晶區(qū)減小從而使微乳面積減小所致［12］。

AR由于其相對分子質(zhì)量較大，水溶性較好，藥物分子不易透過生物膜從而影響其生物利用度。油包水微乳可使藥物脂溶性增強，粒徑小，能夠通過胃腸壁水化層直接與胃腸上皮細胞接觸，促進藥物吸收；此外口服后能夠經(jīng)淋巴吸收從而克服了肝臟首過效應，提高生物利用度。

本實驗中采用白芍總苷（TGP）作為陽性對照藥，對多種炎癥性病理模型如大鼠佐劑性關節(jié)炎模型等具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，其在多個環(huán)節(jié)影響細胞免疫、體液免疫及炎癥過程，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛及保肝和保護血管內(nèi)皮細胞等作用，為多種免疫性疾病的治療提供了良好選擇［13］。本研究表明AR微乳相比AR溶液對佐劑性關節(jié)炎原發(fā)病變小鼠可更好地改善其病理形態(tài)。但制劑促進藥物吸收的機制并不是單一的，仍需進一步研究。

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The preparation and preliminary pharmacodynamics of clematichinenoside microemulsion

DONG Cai-xia1， LI Mo-ying1， YAO Lan1， LI Feng-wen1， LI Yun-man2， LIU Li-fang1

（1.Analysis Department of Chinese Medicine，China Pharmeceutical University，Nanjing 211198，China；2.Department of Pharmacology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

AIMTo prepare homogeneous and stable water in oil（W/O）microemulsion，and evaluate its therapeutic effect to primary adjuvant arthritis mice，provide background of pharmacodynamics for clematichinenoside AR.METHODSTo use lecithin and ethanol as surfactant and cosurfactant，Labrafil M 1944Cs as the oil phase and AR solution as aqueous phase，determine the mass ratio of the components by pseudo-ternary phase diagram.Adjuvant arthritis（AA）model was established through intradermal injection of Freund＇s complete adjuvant（CFA）to right metaleg voix pedis of mice.To use the body weight，swelling rate，thymus and spleen index as the main detection index and to observe the morphology of the diseased region in mice to evaluate the difference among AR solution，AR microemulsion，and TGP which was used as the positive control drug.RESULTSThe formulation of AR microemulsion which was clear light yellow solution was as follows：Km=1 ∶1，50%oil，35%of mixed surfactants，aqueous 15%，with the mean particle size of 10.7 nm.The results showed AR microemulsion could improve the pathological lesion and the morphology in diseased region of primary AA mice.CONCLUSIONAR microemulsion，with smaller particle size and better liposolubility，is able to increase drug bioavailabilityin vivo，which shows that the microemulsion has broad application prospects as a new formulation of drugs.On the other hand，the mechanism of promoting drug absorption is not single and further study is still needed.

clematichinenoside；water in oil microemulsion；pharmacodynamics

book=7,ebook=343

R944.2+7

A

1001-1528（2011）07-1158-06

2010-11-15

國家自然科學基金（30772770）

董彩霞（1985—），女，碩士生，從事中藥分析研究。

*通信作者：劉麗芳（1969—），女，博士，教授，主要從事中藥活性成分和動物藥研究。Tel：（025）86185373，E-mail：liulifang69@126.com