斷腸草生物堿提取工藝研究

閔 勇， 張 薇， 王 洪， 姚立華， 劉 衛*

(1.紅河學院云南省天然藥物與化學生物學重點實驗室，云南蒙自 661100;2.云南省紅河州公安局刑事技術偵查處，云南蒙自 661100)

斷腸草學名鉤吻(Gelsemium elegansBenth)，為馬錢科(loganiaceae)胡蔓藤屬植物。斷腸草主要含有生物堿、萜類等化學成分［1－3］。活性研究證實斷腸草生物堿具有免疫調節、鎮痛鎮靜、抗腫瘤等多種藥用功效［4－6］。前人對斷腸草生物堿的提取工藝做過研究［7－8］，但是，由于斷腸草生物堿組分復雜，不易在工藝研究中對生物堿的得率準確定量。本文以云南省紅河州地區產斷腸草為研究對象，采用正交設計試驗，通過酸性染料比色法測定斷腸草中鉤吻素子類生物堿含量，對生物堿浸提工藝進行評價，為開發地方藥用植物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斷腸草(Gelsemium elegansBenth)采集于云南省綠春縣黃連山(經紅河學院生命科學院 田學軍教授鑒定);鉤吻素子標準品(采購于德國Dr.Ehrenstorfer公司);其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計UV3802(優尼柯)、旋轉蒸發儀N－1100V－W型 (東京理化)、高速萬能粉碎機FW80(上海安銳自動化儀表有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 生物堿含量測定

采用酸性染料比色法［9］

配制鉤吻素子標準溶液 稱取標準品50 mg，溶解，用無水乙醇定容于25 mL量瓶中。取1 mL溶液稀釋10倍，得鉤吻素子標準溶液(200 μg/mL)。分別精密吸取此對照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于試管中依次加入5.0 mL pH為4.0的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，2.0 mL溴甲酚綠酸性染料溶液，5.0 mL氯仿，搖勻，倒入分液漏斗中靜置1 h，分取氯仿層，掃描最大吸收波長為414 nm(文獻報道為410 nm)。在此波長下測定吸光度，以鉤吻素子濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，進行線性回歸，得以下線性方程:Y=0.155 8+0.009 7X，r=0.998 2。

1.3.2 斷腸草生物堿的提取

取斷腸草1 kg粉碎(30～40目)，加入1 000 mL 3%氫氧化鈉溶液拌勻、陰干。采用文獻方法［10］制成藥粉。每次實驗取5g藥粉，按照實驗方案進行浸提，浸提液抽濾得濾液，濾液減壓蒸餾濃縮至總體積一半，吸取濾液2 mL無水乙醇定容于25 mL量瓶中，取2 mL溶液按照1.3.1項方法測定吸光度，計算鉤吻素子含量。

1.3.3 生物堿得率計算公式

ωB……總生物堿得率(%)

ms……生物堿質量(g)(以鉤吻素子計)mc……斷腸草藥粉質量(g)

1.3.4 實驗設計

通過單因素試驗確定影響提取效果的主要因素及水平，然后利用正交試驗對斷腸草生物堿提取條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 溶劑對生物堿堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按固液比1∶10(體積比)分別加入60%、70%、80%、90%的乙醇、氯仿做為浸提溶劑，在30°C加熱回流，提取2次，每次2 h(表示為2 h×2)，合并浸提液，測定生物堿含量，考察溶劑對生物堿提取率的影響，結果見圖1。結果表明，在醇水混合溶劑中80%乙醇對生物堿的提取率最高，略低于氯仿提取率。考慮環保及生產成本因素，選擇80%乙醇進行后續實驗。

圖1 溶劑對生物堿得率的影響

2.2 浸提溫度對生物堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按1∶10的固液比加入80%乙醇，分別在30、40、50、60 °C溫度下浸提2h ×2，考察溫度對生物堿提取率的影響，結果見圖2。結果表明，自30°C開始，生物堿提取率隨浸提溫度而增大。達到50°C后，生物堿提取率呈下降趨勢。這是由于溫度高于50°C時，斷腸草中雜質的溶出量加大，與總生物堿競爭溶劑，使斷腸草總堿提取率降低。選擇50°C為考察溫度。

圖2 浸提溫度對生物堿得率的影響

2.3 浸提時間對生物堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按1∶10的固液比加入80%乙醇，在50 °C分別浸提2 h×2、3 h×2、4 h×2、5 h×2、6 h×2 考察浸提時間對生物堿提取率的影響，結果見圖3。數據顯示生物堿得率隨浸提時間的延長而增加，超過4 h×2后，生物堿得率隨浸提時間變化率趨于平緩，而且浸提時間過長會增加可溶性雜質的濃度，為后續分離純化帶來困難。因此，選定4 h×2進行后續實驗。

圖3 浸提時間對生物堿得率的影響

2.4 固液比對生物堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按不同的固液比加入80%乙醇，在50°C浸提4 h×2、考察浸固液比對生物堿提取率的影響，結果見圖4。圖中顯示，生物堿得率隨固液比增加而升高，當固液比達到1∶20后，生物堿的得率增加趨勢平緩，而過大的固液比會造成溶劑和能源的浪費，并增大后續濃縮的工作量。因此，選擇固液比1∶20為正交設計考慮因素。

圖4 固液比對生物堿得率的影響

2.5 正交實驗優化生物堿提取條件

根據以上單因素試驗結果，設計4因素3水平的正交實驗L9(34)，對影響斷腸草生物堿提取率的4個主要影響因素:溶劑、浸提溫度、提取時間、料液比進行研究，以便進一步優化斷腸草生物堿提取條件，見表1。各因子編碼值及試驗設計和試驗結果分別見表2和表3。

表1 L9(34)正交試驗設計因子及編碼值

表2 L9(34)正交試驗設計與結果

表3正交實驗方差分析結果表明，各處理間的差異顯著(P＜0.05)。對各因素進行回歸分析可知，A(P＜0.01)對實驗結果影響最顯著。根據表3的結果得出擬合方程(1)，模擬的擬合性能良好(R2=93.60%)。從方程可知，A和C的系數為正，B和D的系數為負，說明實驗所選擇的零水平處，Y值隨浸提溫度的升高、浸提時間的延長、乙醇濃度和固液比的降低而增大。

表3 正交實驗方差分析結果

正交實驗結果顯示，在第7組實驗(A1B－1C1D0)條件下生物堿得率最高為0.654%，而極差分析結果顯示最佳實驗結果應為(A1B0C1D0)。進一步驗證實驗結果顯示，在A1B0C1D0條件下生物堿得率為0.639%低于0.654%。因此，斷腸草生物堿的最佳提取條件是A1B－1C1D0:提取溫度為55℃、溶劑濃度為75%、提取時間為4.5 h×2、料液比為1∶20。

3 結論

3.1 通過對正交試驗結果分析可知提取溫度和浸提時間對斷腸草生物堿提取率影響最為顯著，在以后的研究中應該重點研究提取溫度和浸提時間對生物堿提取的影響。

3.2 本試驗通過單因素試驗和正交試驗，優化得出了從斷腸草中提取生物堿的最佳條件:提取溫度為55℃、溶劑濃度為75%、提取時間為4.5 h×2、料液比為1∶20。在該條件下從斷腸草中生物堿提取率可達0.654%。

［1］Kogure N，Ishil N，Kitajima M，et al.Four novel gelsenicine－related oxindole alkaloids from the leaves of gelsemium elegans［J］.Org.Lett，2003，8(14):3085－3088.

［2］Xu Y K，Yang S P，Liao S G，et al.Alkaloidsfrom gelsemium elegans［J］.J Nat Prod，2006，69(9):1347－1350.

［3］Kitajima M，Kogure N，Yamaguchi K，et al.Structure reinvestigation of gelsemoxonine，a constituent of gelsemium elegans，reveals a novel，azetidine－containing indole alkaloids［J］.Org Lett，2005，5(12):2075－2078.

［4］謝 立，韓雪峰.鉤吻中毒的機制、臨床特點及處理［J］.藥物不良反應雜志，2006，8(3):202－204.

［5］Kitajima M，Nakamura T，Kogure N，et al.Isolation of gelsedinetype indole alkaloids from gelsemium elegans and evaluation of the cytotoxic activity of gelsemium alkaloids for A431 epidermoid carcinoma cells［J］.J Nat Prod，2006，69(4):715－718.

［6］吳達榮，蔡 晶，遲德彪.鉤吻素子抗腫瘤作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(5):6－8.

［7］張蘭蘭，王志睿，黃昌全，等.鉤吻總生物堿中鉤吻素子的提取與分離［J］.第一軍醫大學學報，2004，24(9):1006－1008.

［8］陳志慧，周家容.不同提取方法對斷腸草總生物堿提取率的影響［J］.農藥，2007，46(3):176－181.

［9］陳志慧，宋光泉，周家容.酸性染料比色法測定斷腸草總生物堿的含量［J］.江西農業大學學報，2006，28(3):440－443.

［10］張蘭蘭，黃昌全，張忠義，等.均勻設計與正交設計在鉤吻生物總堿提取工藝篩選研究中的應用［J］.第一軍醫大學學報，2003，23(9):914－915.