RP-HPLC測定大鼠口服葛根后血漿中大豆苷元的含量

張 梅， 劉 靜， 劉 軍， 謝學軍

(1.成都中醫藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室;2.成都中醫藥大學臨床醫學院，四川成都 610075)

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。葛根中所含主要活性成分為異黃酮類化合物，大豆苷元是其所含的異黃酮類成分之一，具有抗心律不齊、抗氧化、加速骨細胞生成、降低糖尿病大鼠血小板聚集率等廣泛生理活性［1-2］。作者的前期研究表明，由葛根、丹參等組成的復方制劑對糖尿病性視網膜病變及視神經病變具有較好的防治作用，并對其作用機制進行了深入的研究［3-5］。研究結果也顯示大豆苷元是葛根及復方給藥后血漿中的血藥濃度較高的原型活性成分。為進一步探討葛根及復方防治糖尿病性眼病的藥效物質基礎，了解入血成分的代謝情況，闡明復方制劑的配伍機制，作者采用中藥血清藥物化學實驗方法對葛根給藥血漿中大豆苷元的含量測定方法進行了研究，為后續含葛根復方制劑的研究奠定基礎。

1 儀器及材料

1.1 儀器

島津10AP系列高效液相色譜儀，包括SIL-HTc進樣器，CTO-10ASVP柱溫箱，LC-10ADVP高壓泵，SPD-10AVP紫外檢測器;德國Eppendorf5810R型低溫離心機;Phenomenex Luna C18高效液相色譜柱(4.60 mm ×250 mm，5μm)，Phenomenex C18高效液相保護柱(4 mm×3.0 mm)。

1.2 藥品及試劑

葛根購于成都荷花池中藥材市場，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。大豆苷元(daidzein)對照品，購于成都曼思特生物科技，批號:446-72-0，純度≥98%。精密稱取大豆苷元對照品適量，甲醇溶解后得到濃度為100 μg/mL的對照品貯備液，－20℃密封保存備用。甲醇，色譜純，美國天地TEDIA試劑公司;甲酸，色譜純，美國天地TEDIA試劑公司。

1.3 實驗動物

清潔級SD大鼠，體重(180±20)g，♀♂不限，購自四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所，合格證號:SCXK(川)2006-18。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Luna C18高效液相色譜柱(4.60 mm ×250 mm，5 μm)，Phenomenex C18高效液相保護柱(4 mm×3.0 mm);流動相:甲醇－0.1%甲酸水溶液(60∶40，v/v)，抽濾后超聲波脫氣使用;流速1 mL/min，柱溫25℃;檢測波長260 nm，進樣量 20 μL。

2.2 血漿樣品的制備

取待測血漿0.2 mL加入4倍量(0.8 mL)甲醇，漩渦混勻后于低溫離心機離心(10 000 r/min，10 min)。取上清液于尖底試管，置50℃水浴中并通空氣流揮干，殘渣加0.2 mL甲醇溶解，漩渦混勻后于低溫離心機離心(2 500 r/min，3 min)，取上清液20 μl，注入高效液相色譜儀，測定。

2.3 專屬性及檢測限

分別吸取空白血漿、空白血漿加大豆苷元、葛根給藥血漿、按2.2項下操作，進樣，行HPLC分析，色譜圖如圖1。在此色譜條件下，大豆苷元保留時間為5.7 min，血漿內源性物質及其他雜質基本不干擾樣品的分離測定。血漿中大豆苷元的最低定量濃度為 0.1 μg/mL。

圖1 血漿樣品HPLC圖

2.4 標準曲線的建立

取大豆苷元對照品貯備液適量，甲醇稀釋成系列標準溶液，分別與0.2 mL空白血漿混合，得到梯度為 0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL的大豆苷元血漿樣品，按2.2項下處理。以大豆苷元的峰面積與大豆苷元的濃度進行線性回歸，得到標準曲線為Y=74 069X－29 274，r=0.998 8。大豆苷元在0.1～64 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 方法精密度

取空白血漿，分別加入高、中、中低及低4種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)的大豆苷元對照品，制得各對照品血漿樣品，按2.2項下操作，進樣，測定，根據大豆苷元的峰面積在標準曲線上求得其濃度。在同一天內每一濃度的樣品重復處理5份，進樣測定，其RSD分別為1.6%、5.3%、4.8%、5.7%。于1周內不同日重復測定，其RSD分別為1.8%、2.7% 、7.0% 、9.3% 。

2.6 穩定性

2.6.1 萃取物室溫放置穩定性

取高、中、中低及低 4種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)的大豆苷元對照品血漿樣品，按2.2項下操作，分別于0，8，16h進樣測定，其RSD分別為4.0%、8.4%、9.4%、8.0%，表明萃取物室溫放置16 h穩定性良好。

2.6.2 反復凍融穩定性

取－30℃保存反復凍融1，2，3次的高、中、中低及低 4 種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)對照品血漿樣品，按2.2項下操作，測定，其RSD分別為3.4%、6.2%、7.3%、4.6%，結果表明反復凍融對測定結果無明顯影響。

2.7 回收率

取高、中、中低及低 4種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)的大豆苷元對照品血漿樣品，按2.2項下操作，測定。另取甲醇配制的同濃度大豆苷元對照品溶液直接進樣測定，根據兩者峰面積比值計算回收率，測定結果見表1。結果表明本方法回收率良好。

表1 大豆苷元回收率試驗(n=5)

2.8 血漿樣品中大豆苷元的含量測定

將33只大鼠隨機分為9組，每組3只，禁食(自由飲水)12 h后，其中8組灌胃葛根浸膏，劑量10 g/kg，給藥后分別于 5、15、30、60、90、120、180、240 min肝門靜脈取血，加肝素抗凝，得到葛根給藥血漿，－30℃保存備用;剩余1組作為空白對照血漿，－30℃保存備用。取各血漿樣品0.2 mL，按2.2項下操作，進樣測定，以隨行的標準曲線計算含量，實驗結果見表2。

表2 各血漿供試品中大豆苷元含量(x ± s，μg/mL)

3 討論

3.1 中藥血清藥物化學已經成為中藥有效成分研究及復方配伍機制研究的重要手段［6］。以大豆苷元為指標研究葛根提取物在動物體內的代謝目前國內外文獻報道甚少。作者采用中藥血清藥物化學方法建立了穩定可靠的血漿中大豆苷元的含量測定方法。研究結果為探討大豆苷元的體內代謝規律，闡明葛根及其復方制劑防治糖尿病性眼病的藥效物質基礎奠定了良好的實驗基礎。

3.2 血漿中大豆苷元含量測定相關文獻報道較少，且已有的報道多為測定動物口服大豆苷元單體［7］或幾個異黃酮單體［8］等相對比較單純樣品后血漿中大豆苷元含量，未見研究大鼠口服葛根浸膏后血漿中大豆苷元含量變化的報道。

3.3 血漿樣品的前處理方法，本實驗曾采用甲醇沉淀法、熱水浴法、高氯酸沉淀法及固相萃取法進行試驗，從對待測組分的影響、干擾情況及操作簡便等方面進行考察，確定采用甲醇沉淀法處理血漿樣品。甲醇與血漿的比例亦對分析結果有一定影響，經過實驗最終選擇4倍量甲醇沉淀血漿。此外，大鼠含藥血漿特別是復方給藥血漿中大豆苷元的含量較低，因此在測定過程中需要對血漿中的大豆苷元進行富集。

3.4 大鼠口服葛根浸膏后，血漿中大豆苷元的濃度在20min內達到峰值，這與已有文獻報道結果一致［9-10］，但在60min以后其濃度又開始增加直到4h后降至低谷，原因可能是由于肝腸循環，尚需進一步研究證實。

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［4］謝學軍，王 毅，秦 偉，等.補腎活血中藥對糖尿病大鼠視路NT-3和Nissl小體的影響［J］.中國中醫眼科雜志，2007，17(1):23.

［5］謝學軍，楊 紅，何 宇，等.補腎活血中藥對糖尿病大鼠視路膠質纖維酸性蛋白和髓鞘堿性蛋白表達的影響［J］.中國中醫眼科雜志，2007，17(5):265.

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［8］余 靜，趙人崢，吳 倩，等.同時測定大鼠血清中大豆異黃酮及其他代謝產物含量的液相色譜-串聯質譜方法研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18(5):961-963.

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