小柴胡湯超微飲片與傳統飲片藥效學劑量對比研究

張祥偉， 陳佩虹， 金曉艷， 陳育堯， 黃添友， 佟 麗*

(1.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州 510515;2.廣東九天綠藥業有限公司，廣東河源 517000)

中藥超微飲片是隨著現代超微粉體技術的發展而興起的新型中藥飲片。它以中藥材細胞破壁為目的，使細胞內有效成分快速、大量的釋放出來，提高了中藥材的利用率，從而可以減少臨床用量［1－2］。我們前期對小柴胡湯超微飲片與傳統飲片化學成分溶出特性進行了對比研究，結果表明超微飲片有效成分溶出速度顯著加快，水溶性成分、總黃酮及黃芩苷溶出量是傳統飲片的2倍左右［3］。本實驗在此基礎上進一步探討小柴胡湯兩種飲片藥效學劑量的相關性，為中藥復方超微飲片的臨床使用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑 小柴胡湯超微飲片與傳統飲片(藥物組成:柴胡24 g、黃芩9 g、半夏 9 g、黨參 9 g、生姜9 g、大棗9 g、甘草9 g)由廣東九天綠藥業有限公司提供(批號20080901);卡介苗干混懸劑(Bacillus Calmette－Guerin，BCG，60 mg/支，中國藥品生物制品檢定所，批號2008－1);脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，10mg/支，Sigma 公司);聯苯雙酯滴丸(北京協和藥廠，批號08040108);丙氨酸氨基轉移酶試劑盒(Alanine Aminotransferase Kit，中生北控生物科技股份有限公司，批號:091211－200907);天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒(Aspartate Aminotransferase Kit，中生北控生物科技股份有限公司，批號090591－200908)。1640干粉(GIBCO，批號1279327);新生牛血清(GIBCO，批號 600202);噻唑藍(MTT，Sion－American Biotec，批號2497B516);二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司，批號20080126)。

1.2 動物 SPF級昆明種小鼠，♂性，體重18～22 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物合格證號:NO:0057746，SCXK(粵)2006－0015。

1.3 儀器 Anke TDL－40B型離心機;Sartorius CP225D型電子天平;意大利ECHO LCD全自動生化分析儀 ;英國 RSBiotech GalaxyS 241－220 CO2培養箱;德國LEICA XDP－EC型倒置顯微鏡;日本O－lympus BH－2型顯微鏡;Sigma Diagnostics 201型酶聯免疫檢測儀;德國Leica EG1600型包埋儀;德國LEICA RM 2135型切片機。

2 實驗方法

2.1 對免疫性肝損傷小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性的影響 取小鼠108只，隨機分成空白對照組、模型對照組、聯苯雙酯組(0.15 g/kg)、傳統飲片1組(20.28 g/kg)、傳統飲片2組(10.14 g/kg)、傳統飲片3組(5.07 g/kg)、超微飲片1組(10.14 g/kg)、超微飲片2組(5.07 g/kg)、超微飲片3組(2.54 g/kg)。除空白對照組尾靜脈注射生理鹽水(0.1 mL/10 g)，其余各組按文獻［4－5］制備小鼠免疫性肝損傷動物模型:各組小鼠尾靜脈注射BCG混懸液(劑量:50 mg/kg;濃度:5 mg/mL)。按表1劑量灌胃給予相應藥物(20 mL/kg)，每天1次，連續10 d。第11天禁食不禁水12 h，尾靜脈注射脂多糖(LPS)7.5 μg/只。注射后12 h，眼球采血，常規分離血清，按試劑盒說明書測定血清ALT、AST。

2.2 對免疫性肝損傷小鼠肝臟、脾臟、胸腺臟器指數的影響 眼球采血后，立即取動物肝臟、脾臟、胸腺，稱其濕重，計算各臟器臟器指數(臟器指數=臟器濕重/體重×100%)。

2.3 對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響［6］取小鼠肝臟大葉，10%中性甲醛固定，脫水、包埋、切片、HE染色，制備病理切片，顯微鏡下觀察對肝臟病理損傷的影響。參考中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》分為正常、輕、中、重四個等級，各組分別計數。

2.4 對免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細胞增殖的影響［7］各組隨機選取采血后小鼠3只，常規消毒后無菌取脾臟，制備脾淋巴細胞懸液，過濾、離心，用完全培養基調整細胞濃度至8×106個/mL。每組培養4孔，每孔加樣(200 μL)后，將96孔板置于37℃、5%CO2孵箱培養68 h;取出96孔板，超凈臺下各孔加入MTT溶液20 μL，繼續培養4 h。取出96孔板，各孔吸出培養液170 μL，加入等容積的DMSO，震蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀(波長545 nm)測各孔OD值。

2.5 統計方法 所有數據用mean±SD表達，采用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行處理。計量資料采用單項方差分析(One－way ANOVA):方差齊采用LSD法;方差不齊采用Dunnett T3法。計數資料采用多個獨立樣本非參數檢驗(K Independent Samples Test)。

3 實驗結果

3.1 對免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響 實驗結果表明，傳統飲片臨床等效2倍劑量可顯著降低免疫性肝損傷小鼠ALT與AST水平，與模型對照組比較有顯著性差異(P＜0.05);超微飲片臨床等效0.5倍劑量亦能顯著降低免疫性肝損傷小鼠ALT與AST水平，與模型對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。聯苯雙酯可顯著降低造模動物ALT水平(P＜0.05)，但對改善AST活性水平，與模型對照組比較無統計學意義(P=0.069)。見表1。

表1 對免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(±s)，n=12Tab.1 Effects on serum ALT and AST in immunological liver injury in mice(±s)

表1 對免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(±s)，n=12Tab.1 Effects on serum ALT and AST in immunological liver injury in mice(±s)

與空白對照組比較，#P＜0.05;各給藥組與模型對照組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg)臨床等效量/倍ALT/(mmol/L)AST/(mmol/L)－ － 40.9±4.9 116.2±9.3模型對照組 － － 116.6±32.2#234.9±30.4#聯苯雙酯組 0.15 25 48.7±13.7* 179.6±45.6超微飲片1組 10.14 1 61.1±25.3* 168.1±45.3*超微飲片2組 5.07 0.5 71.1±19.2* 179.0±23.5*超微飲片3組 2.54 0.25 135.6±53.4 258.5±44.5傳統飲片1組 20.28 2 47.3±14.5* 160.8±55.3*傳統飲片2組 10.14 1 67.1±24.0* 170.2±61.4傳統飲片3組空白對照組5.07 0.5 91.3±28.4 227.3±55

3.2 對免疫性肝損傷小鼠脾臟、肝臟、胸腺臟器指數的影響 實驗結果表明，給藥10d后，肝損傷模型組與正常對照組比較脾臟指數顯著增大(P＜0.05)，說明造模后脾臟增大、腫脹明顯，但各給藥組對肝臟、脾臟、胸腺臟器指數無顯著影響。見表2。

3.3 對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響實驗結果表明，超微飲片臨床等效劑量1倍與傳統飲片臨床等效劑量2倍及聯苯雙酯組，均可減輕肝臟損傷程度(病理照片見圖1，HE染色 ×10倍)，與模型對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

3.4 對免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細胞增殖的影響實驗結果表明，超微飲片臨床等效劑量1/2倍與傳統飲片臨床等效劑量1倍劑量時，皆可顯著抑制淋巴細胞的增殖，與模型對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表4。

表2 對免疫性肝損傷小鼠肝、脾、胸腺臟器指數的影響(±s)n=12Tab.2 Effects on organ index in immunological liver injury in mice(±s)

表2 對免疫性肝損傷小鼠肝、脾、胸腺臟器指數的影響(±s)n=12Tab.2 Effects on organ index in immunological liver injury in mice(±s)

空白對照組與模型對照組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg) 臨床等效量/倍 肝臟指數/(mg/g) 脾臟指數/(mg/g) 胸腺指數/(mg/g)58.3±4.1 3.59±0.57 3.39±0.59模型對照組 － － 55.5±3.4 5.38±1.01* 2.69±0.62聯苯雙酯組 0.15 25 53.1±2.7 5.17±1.01 2.64±0.35超微飲片1組 10.14 1 55.5±3.7 6.38±1.92 2.74±0.63超微飲片2組 5.07 0.5 55.2±6.4 5.50±0.73 2.88±0.63超微飲片3組 2.54 0.25 60.5±4.5 5.04±1.02 2.21±0.50傳統飲片1組 20.28 2 61.0±13.9 5.59±1.90 2.61±0.84傳統飲片2組 10.14 1 59.1±7.8 6.36±1.76 2.71±0.69傳統飲片3組空白對照組 － －5.07 0.5 58.7±6.3 4.62±0.93 2.50±1.13

表3 對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理 變化的影響(±s)n=12Tab.3 Effects on liver pathological change in immunological liver injury in mice(±s)

表3 對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理 變化的影響(±s)n=12Tab.3 Effects on liver pathological change in immunological liver injury in mice(±s)

與模型對照組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg)肝臟病理損傷分級臨床等效量/倍－ －12000模型對照組 － － 0 0 4 8聯苯雙酯組 0.15* 25 0 5 5 2超微飲片1組 10.14* 1 0 5 4 3超微飲片2組 5.07 1/2 0 2 5 5超微飲片3組 2.54 1/4 0 0 5 7傳統飲片1組 20.28* 2 1 7 2 2傳統飲片2組 10.14 1 0 3 5 4傳統飲片3組正常 輕度 中度 重度空白對照組5.07 1/2 0 0 5 7

4 討論

小柴胡湯具有和解少陽之功，臨床用于治療少陽病癥見往來寒熱、胸脅苦滿、默默不欲飲食、心煩喜嘔等。現代研究具有保肝利膽、抗炎解熱、免疫調節等藥理作用［8］，臨床廣泛用于病毒性肝炎的治療。病毒性肝炎以乙型病毒性肝炎最為常見，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范圍性疾病。其發病機制復雜，目前認為是HBV感染人體后引起細胞免疫和體液免疫應答，激發自身免疫反應及免疫調節功能紊亂導致肝細胞損傷［9］，從而導致ALT、AST水平升高。本項研究采用BCG+LPS誘導的免疫性肝損傷動物模型，BCG首先激活致敏T淋巴細胞，尤其是致敏肝內Kupfer細胞和巨噬細胞，并大量聚集于肝臟;再注射LPS后進一步激活致敏的巨噬細胞，促使其釋放大量細胞因子，如一氧化氮、腫瘤壞死因子、白細胞介素、自由基、白三烯等造成肝細胞損害［10］。該病理過程與人類病毒性肝炎中Kupffer細胞等非特異性免疫細胞在肝細胞內浸潤并釋放大量細胞因子造成肝細胞損害的病理過程比較相似，被認為是研究乙型病毒性肝炎最公認、經典的動物模型［11］。

圖1 小柴胡湯對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理的改變Fig.1 Effects on liver pathological change in immunological liver injury in mice

表4 對免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細胞增殖的影響(±s)n=4Tab.4 Effects on proliferation of spleen lymphocytes in immunological liver injury in mice(±s)

表4 對免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細胞增殖的影響(±s)n=4Tab.4 Effects on proliferation of spleen lymphocytes in immunological liver injury in mice(±s)

與模型對照組比較，*P＜0.05。

組別 孔數/個臨床等效量/倍劑量/(g/kg) OD值－ 0.646±0.035模型對照組 4 － － 0.797±0.062聯苯雙酯組 4 25 0.15 0.609±0.039傳統飲片1組 4 2 20.28 0.506±0.073*傳統飲片2組 4 1 10.14 0.593±0.072*傳統飲片3組 4 0.5 5.07 0.627±0.111超微飲片1組 4 1 10.14 0.489±0.087*超微飲片2組 4 0.5 5.07 0.486±0.049*超微飲片3組空白對照組4－4 0.25 2.54 0.587±0.118

本實驗采用免疫性肝損傷小鼠模型與脾淋巴細胞增殖實驗，探討了小柴胡湯超微飲片與傳統飲片藥效學作用的劑量關系。實驗結果表明，小柴胡湯兩種飲片均可顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性，減輕肝臟病理損傷程度，抑制脾臟淋巴細胞的增殖，對肝損傷起到較好的保護作用。實驗數據顯示，超微飲片臨床等效劑量的1/2倍即可顯著降低ALT、AST水平，與傳統飲片臨床等效量2倍劑量效應相當;在抑制脾淋巴細胞增殖方面，小柴胡湯超微飲片臨床等效劑量的1/2倍與傳統飲片臨床等效劑量1倍效應相當。病理是診斷、治療疾病及判斷預后的“金標準”，超微飲片臨床等效劑量1倍與傳統飲片臨床等效劑量2倍劑量，均可顯著減輕肝臟損傷程度，兩者效應相當。結合前期小柴胡湯超微飲片與傳統飲片化學成分的對比研究，超微飲片水溶性浸出物、總黃酮及黃芩苷溶出量約為傳統飲片的2倍，參考本實驗藥效學實驗結果，建議超微飲片使用劑量可以減少至傳統飲片使用量的1/2～1/4。

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