牛磺酸對阿霉素所致大鼠心肌線粒體損傷的影響

張曉丹， 蔡瑞雪， 呂高照， 曲彩霞

(1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150076;2.哈爾濱市紅十字醫院，黑龍江哈爾濱 150076)

阿霉素(Adriamycin，Adr)是一種高效的廣譜抗腫瘤藥物，該藥抗瘤譜廣、療效顯著。自1970年用于臨床治療腫瘤以來［1］，被認為是治療實體腫瘤最有效的藥物。但是因其嚴重的心臟毒性限制了它在臨床上的應用［2－3］。研究表明，心肌線粒體是其主要的毒性靶點之一［4－7］。牛磺酸(Taurine，Tau)從發現至今已有160多年的歷史，因1827年首次從牛膽汁中分離出而得名［8］。研究表明，Tau的抗脂質過氧化作用和膜穩定作用可保護線粒體膜免受脂質過氧化，保持線粒體膜的完整性，從而維持線粒體結構和功能的穩定［9］。心肌線粒體損傷是 Adr引起心臟毒性發生的主要標志，而Tau能否通過對心肌線粒體的影響而減緩 Adr引起的心臟毒性，目前還未報道。本實驗旨在探討Tau對Adr所致大鼠心肌線粒體損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠，180～220g/只，共40只，由哈爾濱醫科大學動物實驗研究中心提供，動物合格證號為SCXK(京2007－0001)。

1.1.2 藥品與試劑 Tau(上海生物化學試劑公司提供，純度＞99%);阿霉素由深圳萬樂藥業有限公司生產，批號H44024359;Rhodamine123購于美國Sigma公司，分析純;其它試劑均為國產。

1.1.3 實驗儀器 JEM2100CXⅡ透射電鏡(日本電子公司);2100MP激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司);Langendorff灌流系統(美國Radnoti公司);RF25210熒光分光光度計(日本島津公司);低溫高速離心機(德國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 健康Wistar大鼠40只，♀♂各半，隨機分成5組，每組8只。(1)Adr組:于實驗開始后第2、4天腹腔注射Adr 1 mg/kg，第6、8天腹腔注射 Adr 2 mg/kg，第10、12天腹腔注射Adr 3 mg/kg，第 14、16 天腹腔注射 Adr 4 mg/kg，16天累計用藥劑量達 20 mg/kg［10－11］。(2)Adr+TauⅠ組:Tau 灌胃給藥［12－13］灌胃給藥 100 mg/(kg·d);(3)Adr+TauⅡ組:Tau灌胃給藥200 mg/(kg·d);(4)Adr+TauⅢ組:Tau灌胃給藥400 mg/(kg·d)。各組Tau于實驗第一天起開始給藥，每日灌胃1次，連續16 d，同時，Adr的給藥時間、給藥劑量、給藥次數同Adr組。Tau灌胃給藥是在腹腔注射Adr前30min;(5)陰性對照組:實驗處理同Adr組，腹腔注射等劑量生理鹽水。

1.2.2 心肌組織的電鏡觀察 大鼠處死后，迅速取出心臟，在心尖處取約1 cm3的心肌組織，用2.5%的戊二醛固定，再經漂洗、脫水、浸透、包埋、切片、染色后進行電鏡觀察。

1.2.3 心肌細胞Ca2+濃度的測定 動物脫臼處死，取出心臟，置預冷的50 mol/L Tris－HCl緩沖液沖洗，剪碎，制備勻漿，過濾，離心，棄上清，沉淀用緩沖液復溶后再次離心同前，所得沉淀用緩沖液調整蛋白濃度值為0.8 g/L，考馬斯亮蘭法測定膜懸液［14］蛋白濃度，新鮮即用。取穩定好的細胞，離心，去上清后，用無鈣臺氏液洗滌，然后用Fluo－3AM染色，終濃度為2 μg/mL，避光，在37℃恒溫水浴中孵育0.5 h，離心，用KB液洗滌，將細胞稀釋，放入200～300 μL的浴槽。將Fluo－3AM負載好的細胞在激光掃描共聚焦顯微鏡下掃描細胞內熒光強度，激發波長為488 nm，放射波長526 nm，其熒光值與［Ca2+］i正相關，即以熒光值(FI)變化表示［Ca2+］i變化。

1.2.4 心肌線粒體膜電位的測定

1.2.4.1 心肌線粒體的制備［15］將大鼠饑餓處理多于12 h以上，以去除心肌組織內的糖元和脂肪;斷頭處死大鼠，取下心臟，剝離瓣膜，擠去心臟中的血液，放于冷的蒸餾水中洗去血液;迅速浸入0℃的勻漿介質中(勻漿介質的成分mmol/L:甘露醇225，蔗糖75，EDTA 1和0.25%的牛血清白蛋白，pH 7.4)。用組織剪將心肌剪成米粒樣大小，同時去除脂肪和結締等組織。將剪碎的心肌和勻漿液倒入勻漿管中，在冰浴下進行勻漿，進行20 min，勻漿基本徹底。按照差速離心法分離線粒體。采用考馬斯亮蘭法測定線粒體蛋白含量，調整線粒體蛋白濃度為1 mg/mL。

1.2.4.2 膜電位的測定 參照文獻［16］將反應介質(蔗糖150 mmol/L，氯化鎂5 mmol/L，琥珀酸鈉5 mmol/L，魚藤酮 2.5 mmol/L，Hepes 20 mmol/L)加入到各組線粒體懸液中，濃度為26 μmol/L的Rhodanmine123，室溫下反應5 min;Rh123的激發波長為503 nm，發射波長為527 nm的條件下測定熒光強度。

1.3 統計學處理 數據以均數±標準差表示，均數比較用單因素方差分析(one－way ANOVA)，所有實驗數據采用SPSS 16.0進行統計分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結果

2.1 Tau對心肌細胞超微結構的影響 見圖1。從圖中可見:A.陰性對照組:心肌細胞完整，肌原纖維排列整齊，心肌纖維紋理清晰。線粒體結構清晰，膜較完整，基質清楚。B.Adr組:肌原纖維排列紊亂，肌纖維斷裂;線粒體腫脹出現空泡變，內腔擴大，膜模糊不清;嵴排列稀疏，有斷裂，肌節消失。C.Adr+TauⅠ組:對心肌保護作用較小，線粒體腫脹輕微減輕，但仍有空泡變出現，嵴仍有改變。D.Adr+TauⅡ組:心肌纖維腫脹進一步減輕，仍有個別線粒體出現輕度腫脹，肌節斷裂減少。E.Adr+TauⅢ組:心肌顯微結構基本恢復正常，線粒體腫脹減輕，結構較完整，嵴排列較整齊、致密，基本接近陰性對照組。

圖1 Tau對心肌細胞超微結構的影響Fig.1 Effects of Tau on ultrastructure of cardiac muscle cell in electron microscope

2.2 Tau對心肌細胞Ca2+含量及線粒體膜電位的影響 由表1可知:與陰性對照組相比，Adr組Ca2+濃度明顯升高，TauⅢ組能使心肌細胞內Ca2+濃度明顯下降(P＜0.01)，TauⅡ組能使心肌細胞內Ca2+濃度顯著降低(P＜0.05)，TauⅠ組心肌細胞內Ca2+濃度明顯升高(P＜0.05)。說明TauⅢ組能降低心肌細胞內Ca2+濃度，緩解鈣超載。而與陰性對照組相比，Adr組心肌線粒體膜電位顯著下降(P＜0.05);給予Tau可使線粒體膜電位升高，TauⅡ、Ⅲ組可明顯升高心肌線粒體膜電位(P＜0.05)，提示Tau可明顯減輕Adr所致的大鼠心肌線粒體損傷。

表1 Tau對心肌細胞Ca2+含量、線粒體膜電位的影響(n=8，±s)Tab.1 Effects of Tau on the［Ca2+］i and MMP of myocardial mitochondria(n=8，±s)

表1 Tau對心肌細胞Ca2+含量、線粒體膜電位的影響(n=8，±s)Tab.1 Effects of Tau on the［Ca2+］i and MMP of myocardial mitochondria(n=8，±s)

與陰性對照組比較*P＜0.05，與Adr組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。*P ＜0.05 **P ＜0.01 vs.Normal△P ＜0.05 △△P ＜0.01 vs.ADR group

組別 劑量/(mg/kg) Ca2+熒光值－ 23.35±4.41 144.82±34.25 Adr組 － 31.84±5.06* 102.56±31.77*Adr+TauⅠ組 100 34.58±2.32 116.10±27.56 Adr+TauⅡ組 200 25.66±0.40△ 133.37±33.61△Adr+TauⅢ組 400 21.11±2.50△△ 141.07±29.12膜電位熒光強度陰性對照組△

3 討論

自從1973年Lefrak首次報告了Adr心臟毒性，認為它比骨髓抑制作用、消化道和腎臟毒性等更為危險，由于心臟毒性而限制其作用。因此越來越多的學者就Adr引起的心臟毒性而進行了研究。研究認為，目前對Adr心肌毒性的機制尚未徹底清楚，可能包括自由基、鈣超載、細胞凋亡和線粒體損傷等多因素共同作用的結果，多因素之間互相聯系、互為因果，形成Adr心臟毒性的惡性網絡，共同導致心臟毒性的發生和發展［17］。本實驗就Adr可能產生的機制進行了研究，并從該機制著手，觀察了Tau對Adr大鼠心臟毒性的影響。

Adr引起心臟毒性的可能機制有:鈣超載和線粒體損傷。正常心肌細胞中Ca2+大部分儲存于線粒體、肌漿網及肌膜上。Adr能破壞心肌細胞膜結構的完整性，影響膜的滲透性刺激線粒體和肌漿網，將Ca2+釋放至胞質，加重 Ca2+超載［18］。線粒體在心肌細胞的能量代謝中起重要作用，其攝取Ca2+的速度很慢，但存儲量很大，是調節細胞內Ca2+濃度的主要細胞器之一。研究表明Adr通過一種特異性的線粒體通透性轉運阻滯劑環孢菌素A作用于鈣釋放通道而破壞線粒體內Ca2+的調節作用［19］。大量證據表明，在Adr引起的心臟毒性發病過程中，線粒體是主要靶向器官。Adr心臟毒性時產生大量氧自由基，線粒體發生脂質過氧化反應使線粒體受損，極容易發生線粒體功能障礙。Ca2+的蓄積與線粒體損傷，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成減少。Adr還可使線粒體的NADH脫氫酶、細胞色素氧化酶、細胞色素還原酶及琥珀酸脫氫酶的活性降低，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成障礙，嚴重影響心肌的收縮和舒張功能。

本實驗結果顯示，Adr組大鼠心肌細胞超微結構明顯改變，表現為線粒體彌漫性腫脹，內腔擴大，空泡變。Adr可使心肌細胞內Ca2+濃度增加，加重鈣超載，也可顯著降低線粒體膜電位。說明Adr所致心臟毒性模型制備成功，提示線粒體損傷可能是阿霉素引起心臟毒性的主要機制。上述結果表明大劑量的Tau可改善Adr所致的大鼠心肌線粒體的病理改變，減輕鈣超載，提高線粒體膜電位。說明Tau有可能是通過減緩鈣超載及減輕線粒體損傷來防治Adr所致的心臟毒性。小劑量的Tau輕微的減輕線粒體損傷，但加重了鈣超載，對心臟毒性并不能起有效的防治作用。

綜上所述，大劑量Tau可以非常顯著的改善線粒體損傷，鈣超載及提高膜電位，且無毒副作用。同時本實驗還證明了小劑量Tau不適用于防治Adr所致的心臟毒性。目前隨著Adr在腫瘤治療領域中具有不可替代的作用，其心臟毒性也越來越受到人們的重視。Tau能有效的防護心腦毒性［20］，為臨床應用Adr后的心肌保護性輔助用藥提供了治療策略。

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