煙草SSR熒光標(biāo)記與毛細管電泳檢測技術(shù)研究

陳雅瓊，李鳳霞，李錫坤，徐 軍，張 磊，王紹美，孫玉合*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 10081）

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，也是生物技術(shù)研究的模式植物之一。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用DNA分子標(biāo)記開展煙草的遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究取得了一定進展[1]。最初多采用RAPD標(biāo)記[2]，但是該方法存在著多態(tài)性低和穩(wěn)定性差的問題，其應(yīng)用受到了一定的限制。此外還有研究者采用AFLP和ISSR標(biāo)記方法[3-4]。在基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記中，simple sequence repeats（SSR，又稱微衛(wèi)星microsatellites）分子標(biāo)記技術(shù)由于其具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、有高度變異、微衛(wèi)星在染色體上分布均勻等諸多優(yōu)點[5-8]，已成為研究煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與基因組作圖的首選標(biāo)記。與其他植物相比，煙草 SSR標(biāo)記研究起步相對較晚。直到2007年，Bindler等[9]首次報道了煙草的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳圖譜，總共282個微衛(wèi)星標(biāo)記擴增的293個SSR位點被定位到煙草24個連鎖群上。

傳統(tǒng)的 SSR操作通過聚丙烯酰胺凝膠電泳配合其他一些生物技術(shù)來進行基因的多態(tài)性分析，方法雖然成熟但耗時、耗力、非自動化，在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析時仍存在相當(dāng)大的難度，主要體現(xiàn)在不同等位變異難以準(zhǔn)確識別、不同批次反應(yīng)數(shù)據(jù)難以統(tǒng)一處理等[10]。另外一種可以用來進行基因多態(tài)性分析的手段為高效液相色譜法，但由于它的分辨率較低和成本較高而缺乏應(yīng)用前景。因此，大規(guī)模的SSR研究迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、高效率的檢測方法。

熒光標(biāo)記毛細管電泳檢測技術(shù)因具有高效、自動化的優(yōu)點，在大麥[11]、黑麥草[12]、萵苣[13]、竹子[14]等多種植物分子標(biāo)記研究中顯示出極為廣闊的應(yīng)用前景。該法使用三引物擴增微衛(wèi)星位點，采用D2、D3和D4三種不同顏色的熒光染料標(biāo)記微衛(wèi)星引物，將不同熒光標(biāo)記、擴增片段長度差異較大的PCR 產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品（內(nèi)標(biāo)）在同一泳道中進行電泳。通過毛細管電泳，將結(jié)果自動記錄在計算機上，利用 CEQ片段分析軟件進行圖像收集和分析，精確計算出微衛(wèi)星等位變異擴增片段的大小，實現(xiàn)了 SSR 標(biāo)記與高效、自動化技術(shù)的結(jié)合[15]。李鳳霞等[16]應(yīng)用類似的技術(shù)，對煙草屬內(nèi)4種類型的5份栽培煙草以及28份煙草野生種進行了熒光AFLP分析，鑒定了它們的親緣進化關(guān)系，在國內(nèi)尚未見其他相關(guān)的報道。

本研究通過對9份煙草材料的SSR位點進行熒光檢測分析，建立并優(yōu)化毛細管電泳熒光檢測技術(shù)應(yīng)用于煙草SSR分子標(biāo)記研究的技術(shù)體系，為實現(xiàn)自動化煙草遺傳多樣性研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

9份有代表性的材料選自農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因煙草環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（青島）（表 1）。采集營養(yǎng)生長期的葉片，經(jīng)液氮速凍后于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組 DNA 提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京），按說明書分離煙草葉片的總DNA，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測 DNA質(zhì)量及濃度。稀釋至 30～50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系總體積為15 μL，其中模板 DNA（30～50 ng/μL）1.5 μL，10×reaction buffer（KCl）1.2 μL，Mg2＋（25 mmol/L）0.8 μL，dNTP（25 mmol/L）1.2 μL，TagDNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μL，SSR 反向引物（10 μmol/L）1.2 μL，適當(dāng)摩爾比例帶有M13尾巴序列的特異正向引物10 μmol/L及熒光標(biāo)記的通用型M13引物16 μmol/L 共 1.2 μL，ddH2O 7.7 μL。在保持其他因素一致的條件下，改變特異正向引物與M13引物的比例，篩選最優(yōu)比例。PCR反應(yīng)中采用的引物是從已公布的煙草 286對 SSR多態(tài)性引物中篩選出來的PT20202（表2），其擴增帶型清晰、多態(tài)性高、重復(fù)穩(wěn)定性好。其余試劑購自TaKaRa。

采用ABI Applied Biosystem PCR儀進行 PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。其中，引物PT20202退火溫度經(jīng)溫度梯度擴增篩選所得。

1.2.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測PCR擴增產(chǎn)物中加入3 μL 6×Loading buffer（36%甘油；0.035% 二甲苯胺藍；30mmol/L EDTA；0.05%溴酚藍），在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓180 v電泳75 min左右。采用優(yōu)化的快速銀染法：0.1%的硝酸銀染12 min，去離子水漂洗20 s，顯影液（10 g NaOH，0.2 g Na2CO3溶于500 mL水中）顯色10 min，用去離子水漂洗2遍。

表1 供試材料及類型Table1 The tested tobacco varieties

表2 SSR引物類型及序列Table2 The types and sequences of SSR primers

1.2.4 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)檢測 PCR產(chǎn)物在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)（Beckman Coulter, USA）上進行SSR多態(tài)性分析。該系統(tǒng)采用熒光標(biāo)記、毛細管電泳分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)。PCR產(chǎn)物稀釋15倍，吸取稀釋后的PCR產(chǎn)物作為分析樣本加入樣品板，每孔加入適當(dāng)比例的SLS（上樣緩沖液，甲酰胺）與分子量內(nèi)標(biāo)-400（internal standard 400）。樣品板樣品孔內(nèi)加入半滴礦物油以防止在CEQ8000上運行時反應(yīng)物蒸發(fā)，緩沖液板中對應(yīng)孔內(nèi)加入 3/4體積的緩沖液。選擇 HUM-STR 方法（毛細管溫度 50 ℃；進樣 2.0 KV，30s；電泳4.8 KV，65 min）進行電泳分析。

通過檢測熒光標(biāo)記，所得的數(shù)據(jù)被自動收集起來，利用CEQ片段分析軟件（Beckman Coulter，USA）自動統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，并將有效峰轉(zhuǎn)化為“0、1”原始數(shù)據(jù)矩陣。

2 結(jié) 果

2.1 煙草SSR熒光標(biāo)記與毛細管電泳檢測技術(shù)體系的建立

2.1.1 PCR反應(yīng)體系中M13引物與特異正向引物的摩爾比例（以下簡寫為M:T）的確定 為了找到M13引物與特異正向引物之間的最佳比例，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測作為對比進行了分析。圖 1是9份煙草材料M:T分別為5:5、6:4、7:3、8:2時的擴增效果圖。結(jié)果表明,帶有 M13尾巴的特異正向引物過多時會有非特異性擴增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖1A1-9），過少時條帶較淡（圖1C 1-9及1D 1-9），且特異正向引物越少條帶越淡；而當(dāng)M:T=6:4時（圖1B1-9），擴增條帶清晰、有明顯的多態(tài)性。因此可以確定M:T的最適摩爾比例是6:4。

圖1 M13引物與特異正向引物不同摩爾比例對擴增效果的影響，M:T比例A為5:5，B 6:4，C 7:3，D 8:2；泳道1-9依次是9份煙草材料Fig.1 Effects of different molar ratios of M13 primer and specific forward primer on the amplification

2.1.2 上樣體系中SLS、分子量內(nèi)標(biāo)-400及樣本量的摩爾比例的確定 進行毛細管電泳分析時，分子量內(nèi)標(biāo)-400與SLS的比例一般不小于1:100。結(jié)果表明，加入 30 μL SLS，0.3 μL 分子量內(nèi)標(biāo)-400，應(yīng)該加入1.0 μL 稀釋后的PCR產(chǎn)物，這樣出峰有序而且無關(guān)峰較少。為降低成本，將 SLS的用量從30 μL 減少到 25 μL、20 μL、再到 15 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗的一致性和重復(fù)性較好、體系幾乎不受影響，CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性亦表現(xiàn)良好。因而可以確定，上樣體系中 SLS:分子量內(nèi)標(biāo)-400:樣本=300:3:10，SLS 用量為 15 μL。

2.2 煙草SSR位點分析

2.2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 利用引物PT20202對9份煙草材料進行擴增，擴增產(chǎn)物通過8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測（圖 1B1-9）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這對引物的擴增產(chǎn)物在這些煙草材料之間存在多態(tài)性，并且擴增帶型清晰，可以用于對供試材料進行基因組多態(tài)性分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，此對引物具有較好的鑒別能力，采用這種高鑒別力的引物可能用較少的引物數(shù)目就能將所有供試材料分開。

2.2.2 毛細管電泳熒光檢測 采用上述所建立的技術(shù)體系，在 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上利用熒光標(biāo)記毛細管電泳檢測擴增產(chǎn)物的等位基因片段。圖2為 SSR熒光標(biāo)記毛細管電泳檢測法對引物PT20202擴增片段進行分析的部分結(jié)果，微衛(wèi)星分析結(jié)果表明，總體信號清晰，9個DNA樣品電泳峰型各異，即每個DNA樣品具有特異的指紋圖譜，易于判斷。引物PT20202擴增出的多態(tài)性片段長度在100 bp左右，而且在1個SSR位點上共檢測到2個等位基因，分別是93 bp和113 bp。因此，它們可用作鑒定9個煙草材料的分子標(biāo)記。

圖2 毛細管電泳熒光檢測G28（A）、N.sylvestris ×N.tomentosiformis（B）、N.sylvestris（C）和K326（D）微衛(wèi)星標(biāo)記Fig.2 The microsatellite fluorescence detection graphs of G28(A), N.sylvestris ×N.tomentosiformis(B), N.sylvestris(C) and K326(D) by capillary electrophoresis

3 討 論

3.1 三引物對構(gòu)建SSR分析體系的重要性

熒光標(biāo)記引物與毛細管電泳檢測相結(jié)合，可以實現(xiàn)對煙草SSR進行自動化分析。三引物的構(gòu)成是確立CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)最佳技術(shù)體系的關(guān)鍵，也是自動化分析的前提與基礎(chǔ)。PCR反應(yīng)中所用的三種引物量的關(guān)系是：M13引物與5’端加有M13尾巴序列特異正向引物的摩爾比例通常是 1～9:1；特異正向引物與 M13引物量的加和等于普通反向引物的用量。在反應(yīng)的初始階段，帶有M13尾巴的特異正向引物和普通反向引物一起特異性地擴增微衛(wèi)星，當(dāng)特異正向引物消耗殆盡，有熒光標(biāo)記的M13引物就會代替其發(fā)揮作用，產(chǎn)生有標(biāo)記的擴增等位基因。PCR反應(yīng)體系中M:T通過影響等位基因的擴增效率，進而影響 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)對SSR的多態(tài)性分析。因而，把握好體系中引物的各種比例關(guān)系是準(zhǔn)確進行微衛(wèi)星分析必不可少的。

3.2 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)中上樣體系對構(gòu)建SSR分析體系的重要性

進行毛細管電泳分析時，上樣體系中所加SLS、分子量內(nèi)標(biāo)-400及樣本量均影響熒光檢測的信號。分子量內(nèi)標(biāo)-400與SLS的比例一般不小于1:100；所用PCR產(chǎn)物的數(shù)量取決于PCR反應(yīng)的效率以及擴增產(chǎn)物相對的信號強度，其中后者隨標(biāo)記染料種類的變化而變化。因此，比例適當(dāng)?shù)纳蠘芋w系能夠保證微衛(wèi)星分析的順利進行。此外，為了節(jié)約成本，在不影響檢測效果的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量縮小上樣體系。

3.3 毛細管電泳熒光檢測與銀染法檢測效果比較

在利用銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測時，同一膠板上所有樣品帶譜間相對位置的識別以及不同膠板得到的 SSR數(shù)據(jù)的統(tǒng)一會給數(shù)據(jù)收集和分析帶來很大的困難[15]。CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)在數(shù)據(jù)收集和處理上采用 CEQ軟件分析，可以自動讀出目標(biāo)DNA片段的大小，將峰譜轉(zhuǎn)化為0與1矩陣，進而進行計算機運算，這樣不僅使工作效率大大提高，獲得比銀染法更多的全基因組變異信息，而且得到的數(shù)據(jù)也更加準(zhǔn)確。

在本研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合毛細管電泳熒光檢測技術(shù)在其他植物遺傳分析中的應(yīng)用，大量實驗說明該技術(shù)較銀染法檢測效果更為理想。

3.4 多重PCR體系的建立

多重PCR技術(shù)是采用3種不同顏色的熒光染料對有相同序列的M13引物分別標(biāo)記，使通過一次毛細管電泳可以進行3種以上不同微衛(wèi)星標(biāo)記的多重分析。這一技術(shù)體系的建立，可以有效降低成本，提高通量，使微衛(wèi)星檢測更為簡單高效。在實際操作中，關(guān)鍵在于把握好通過每次毛細管電泳的等位基因片段大小要有區(qū)分。首先應(yīng)該選擇擴增產(chǎn)物差異較大的基因標(biāo)記來組合多重PCR體系，以避免不同位點之間產(chǎn)生混淆。其次是依據(jù)峰圖的高低，不斷優(yōu)化PCR擴增體系，通過調(diào)整模板DNA與引物的相對用量，最終得到雜帶少、信號強的基因標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本研究利用毛細管電泳熒光檢測技術(shù)分析煙草SSR多態(tài)性，建立了CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)用于煙草微衛(wèi)星分析的最佳技術(shù)體系：PCR反應(yīng)中，M:T＝6:4；進行毛細管電泳時，PCR產(chǎn)物以15倍梯度稀釋、SLS:分子量內(nèi)標(biāo)-400:樣本=300:3:10；上樣體系可縮小到 SLS用量為 15 μL。將 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)用于煙草 SSR分子標(biāo)記研究是可行的。本研究得到的2個煙草微衛(wèi)星位點，可用于區(qū)分煙草種群以及構(gòu)建煙草遺傳圖譜。

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