普通煙草種質資源的SSR標記與指紋圖譜分析

徐 軍，劉艷華，任 民，牟建民，張興偉，陳雅瓊，王志德*

（1.農業(yè)部煙草類作物質量控制重點開放實驗室，中國農業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

煙草在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位，煙草種質真實性和純度直接影響產品的質量，因此，種質鑒定是煙草生產和研究工作中的重要一環(huán)。傳統(tǒng)的鑒定方法主要有形態(tài)鑒定、蛋白及同工酶鑒定[1]，但這些方法易受實驗材料所處發(fā)育時期、取樣部位和環(huán)境等多種因素的影響，準確率不高，且實驗過程復雜，操作程序繁瑣，難以大規(guī)模推廣應用。近年來發(fā)展的分子標記技術克服了傳統(tǒng)方法的缺點，被越來越多地應用到種質鑒定工作中，分子標記技術種類較多，常用的有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，其中SSR標記具有結果可靠，重復性好，多態(tài)性豐富，操作簡單，呈共顯性遺傳等特點[2-3]，已被應用于水稻[4]、玉米[5]、櫻桃[6]等多種作物的種質鑒定中。

本研究利用SSR標記技術，從分子水平上鑒別區(qū)分了80份普通煙草種質，并構建了它們的SSR指紋圖譜，驗證了用SSR標記鑒別煙草種質的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選取煙草核心種質中的 80份普通煙草種質為材料，包括14份白肋煙，9份香料煙，6份雪茄煙，26份烤煙，25份曬煙。材料均由國家煙草種質庫提供。

1.2 DNA提取

供試材料溫室育苗，長成幼苗后用CTAB法提取基因組總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測含量后保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3 SSR檢測

實驗所用286對SSR引物序列為Bindler等[7]人公布，下載自http://solgenomics.net。PCR擴增總體 15 μL，其中包括 1×PCR 緩沖液，MgCl21 mmol/L，dNTPs各1.2 mmol/ L , Taq酶1 U，引物0.4 μmol/L ,基因組 DNA 20 ng ，PCR反應程序為：94 ℃預變性 5 min 后，94 ℃ 變性 45 s ，58 ℃ 退火 45 s ，72 ℃ 延伸45 s ，35個循環(huán)后，72 ℃再次延伸10 min，最后4 ℃保存。其中退火溫度要根據(jù)引物的不同而調整。

1.4 電泳及染色

PCR產物用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，以1×TBE作緩沖液，180 V恒壓進行電泳。電泳后，銀染，拍照。銀染方法如下：

卸板后漂洗；然后在染色液（1 L水中溶解2 g硝酸銀，5 mL冰乙酸，100 mL無水乙醇）中染色10 min；再次漂洗后放入顯色液（1 L水中溶解15 g氫氧化鈉，3 mL 37 %甲醛）中顯色。

2 結 果

2.1 SSR多態(tài)性分析

通過對286對SSR特異性引物進行篩選，從中選出8對反應穩(wěn)定，擴增條帶清晰，多態(tài)性強的引物，對這80份材料DNA進行擴增（圖1），共得到85個等位位點，其中引物 PT20189、PT20287、PT30380、PT30403的等位位點數(shù)最少，為9個；引物 PT20372、PT20213的等位位點最多，為 14個，平均為10.6個（圖2）。通過POPGENE軟件分析可知8個引物等位位點多態(tài)性信息含量 ( P I C)變幅為0.63～0.88，平均為0.81（表1）。

2.2 SSR指紋圖譜構建

以“1”和“0”分別表示擴增產物的“有”和“無”，將 8對SSR引物產生的 85 個多態(tài)位點依次排序，形成一個 SSR數(shù)據(jù)矩陣（表2），建立品種計算機化的 DNA 指紋，以區(qū)分供試的每個品種。對SSR數(shù)據(jù)矩陣聚類分析，發(fā)現(xiàn)這8對引物可完全將這80份煙草種質區(qū)分開來（圖3），每一份種質都有自己獨特的指紋圖譜（圖4）。

圖1 引物PT30380對部分材料擴增結果Fig.1 The amplified result of part of materials by primer PT30380

圖2 引物PT20202擴增的多態(tài)性條帶Fig.2 The polymorphic bands amplified by primer PT20202

表1 8對SSR引物名稱, PIC值, 檢測到的等位位點數(shù)目Table 1 The name of 8 pairs of SSR primer, PIC of primers and the number of the variance allele

表2 部分材料對引物PT20189和PT20287的擴增結果Table 2 The PCR results of some materials by primer PT20189 and PT20287

圖3 80份煙草種質基于SSR分析的UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram derived from UPGMA cluster analysis based on SSR analysis method among 80 tobacco germplasms

圖4 485號材料對8對引物擴增的指紋圖譜Fig.4 The DNA fingerprint of material NO.485 amplified by 8 primers

3 討 論

目前用分子標記鑒定煙草種質的研究還較少，RAPD技術有過報道[8-10]，但RAPD標記的重復性和穩(wěn)定性一直存在爭議，需要嚴格控制反應條件才能得到理想結果[9]，且擴增位點多態(tài)性不如SSR 標記豐富。如Coussirat J C[11]用160 對引物對32份煙草種質進行了RAPD分析，其中9對引物擴增出了29個多態(tài)性位點，平均每對引物3.2個。許明輝等[9]利用235對引物對23份煙草種質進行RAPD分析，其中16對引物擴增出46個多態(tài)性位點，平均每個引物2.9個。SSR引物在煙草上的發(fā)展和其他作物相比較晚，直到 2007年，Bindler等[7]首次報道了煙草的微衛(wèi)星標記遺傳圖譜，因此，SSR在煙草研究上應用還不廣泛。本實驗中，從286對SSR引物中篩選的8對引物共擴增出85個多態(tài)性位點，平均每對引物10.6個，多態(tài)性明顯優(yōu)于RAPD引物，這與劉冠明等[12]的研究結果一致。這幾對引物的重復性驗證結果也表明 SSR標記的重復性和穩(wěn)定性很好。此外，實驗中還發(fā)現(xiàn)SSR標記對反應條件要求不嚴格，如反應對DNA模板質量要求不高，略微改變反應體系不會對 PCR反應結果造成明顯影響，與朱英等[13]的報道也相符合。因此，與RAPD標記相比，SSR標記更適合于普通煙草種質鑒定和指紋圖譜構建工作，SSR標記將會在煙草種質鑒定工作中發(fā)揮更加重要的作用。

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