顯微鏡檢測用蔗糖和蔗糖產品摻假的蜂蜜

黃文誠 譯自Apidologie（1995）26,131-139

蜂蜜摻假是盡人皆知的問題，已有許多分析方法檢測用各種糖和廉價糖漿偽造的蜂蜜。在某些熱帶國家，當地市場出售的蜂蜜可能直接添加蔗糖、蔗糖漿、加熱酸水解蔗糖得到的蔗糖漿或者給蜜蜂喂糖獲得的“蜜”。通過常規的化學分析，諸如果糖、葡萄糖、蔗糖、羥甲基糠醛含量及淀粉酶值，這樣蜂蜜的摻假容易被檢測出。

然而，在許多發展中國家，不一定有上述常規分析實驗室，借助簡單的顯微鏡分析可能檢測用蔗糖及蔗糖產品的摻假蜂蜜。蔗糖有內在來源的指示物。它含有來源于甘蔗莖的許多有特性的顆粒：薄壁細胞、硬化細胞、表皮細胞、環形導管的單環及甘蔗淀粉。這些顆粒存在于原糖、精制白糖和紅糖（B型）以及糖蜜，但是不含在甜菜糖、槭糖和印度尼西亞棕櫚糖中。

文獻中沒有介紹過蜂蜜中蔗糖顆粒顯微鏡分析的具體方法。有些研究人員提到蜂蜜沉淀中除花粉以外還存在其他結構的顆粒，但是沒有給出植物細胞的詳細識別方法。

在蔗糖及蔗糖產品用于摻假的事例中，如同經典的花粉分析，離心1∶2蜂蜜水溶液，得到的殘渣中除了花粉、甘露成分和草酸結晶以外，含有表示特性的甘蔗植物細胞。將水洗的殘渣安裝在甘油漿中以后，進行顯微鏡分析。采用交叉偏振和1級紅色阻滯片，蔗糖的存在立刻顯示出蔗糖細胞的明亮的圖像。圖1～7是典型的形式。乙酸水解法是孢粉分析的程序，花粉沉淀通過無水乙酸或硫酸的乙酸水解以獲得清晰的花粉細胞壁，此法不能用于檢查這些植物細胞，因為在乙酸水解過程中這些細胞被破壞了。

圖1 蜂蜜中蔗糖的硬化細胞，正常光，750×

圖2 蜂蜜中蔗糖的硬化細胞，交叉棱鏡，750×

圖3 蜂蜜中蔗糖的薄壁細胞，交叉棱鏡，750×

圖4 蜂蜜中蔗糖的單環，正常光，750×

圖5 蜂蜜中蔗糖的單環，交叉棱鏡，750×

圖6 蜂蜜中蔗糖的表皮細胞，正常光，750×

圖7 蜂蜜中蔗糖的表皮細胞，交叉棱鏡，750×

偏光顯微鏡對于這種分析尤其有用，因為交叉棱鏡在黑色背景下具有由許多纖維素組成的細胞壁的植物細胞顯示1級白干擾色；許多晶體和固有的淀粉顆粒也可看出。然而，花粉、酵母和真菌孢子光學上是不活躍的，在交叉棱鏡下不能被看出。插入1級紅色阻滯片，黑色背景變成酒紅色，花粉、酵母和真菌孢子能被辨別，但是不被照亮。然而，取決于它們在顯微鏡視野的方向，光學活性的植物細胞（和晶體及固有的淀粉）顯示2級亮藍色（紅色I加白色I）或1級黃干擾色（紅色I減白色I）。

本研究中，對蔗糖組織的顯微鏡分析結果與蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖含量以及羥甲基糠醛值進行了比較。在某些熱帶（亞熱帶）國家，蜜蜂從切割的或燃燒的甘蔗莖采集滲出液。因此，在這項研究中也包括一些蔗糖蜜的顯微鏡分析。

1 材料和方法

1.1 樣本

蜂蜜樣本是1987年進行調查時從菲律賓得到的。兩個高度懷疑的樣本是從地方市場購買的，在荷蘭食品檢驗局分析。另外8個蜂蜜樣本來自尼泊爾加德滿都，它們是在BETRESP實驗室進行化學和顯微鏡分析時遇到的。通過對300多個蜂蜜樣本的分析，BETRESP為尼泊爾建立蜂蜜國家標準奠定了基礎。由于一些樣本含有植物組織，也在荷蘭阿姆斯特丹食品健康保護檢驗局實驗室分析它們。

蔗糖樣本是在尼泊爾加德滿都商店購買的。純蔗糖蜜是從荷蘭阿姆斯特丹食品檢驗局得到的。1個樣本來自古巴，另一個來自馬德拉（群島）。

1.2 分析方法

顯微鏡分析是按照蜜源植物國際委員會發布的方法進行，在20 ml水中溶解10 g蜂蜜（或10 g蔗糖），離心，用水洗出沉淀，再次離心，取沉淀放入100 μl水中。為進行定量分析，取10 μl懸液放在載玻片的1cm2上，干燥，覆蓋甘油膠。蔗糖顆粒用交叉偏振和1級紅色阻滯片在400倍下計數。其余懸液放在另一載玻片，干燥，覆蓋甘油膠。這個玻片用于定性鑒定，必要時用同樣的顯微鏡技術進行低數量計數。

蔗糖的薄壁細胞近似長方形，有各種大小：細胞大部分長為50～100um,寬約40～60um。也有近圓形的。硬化細胞長方形，長約100～200um，寬40～50um。這兩種細胞都有光學激活的細胞壁藍色（北方或西南方向）和黃色（西北方或東南方向）的偏光色。薄壁細胞和硬化細胞的表面具有許多直徑2～3um的小坑，每個小坑有1個偏振交叉或具光學激活的外界（黃色或藍色）的單一射線（圖1～3）。

因為它們有自己的小坑為特性，薄壁細胞和硬化細胞在定量工作中一起計數，表示為10 g蜂蜜中它們的總數。細胞的聚集部分在每次計數時作為1個細胞。環形導管的單環細胞也有特性。它們的直徑約30～50um（圖4）。在每個單環顯示藍色和黃色偏振光色；顏色被小的紅色帶（圖5：黑色）交替改變。單環的計數表示為10g蜂蜜中的總數。

表皮細胞的特點是它們的起伏的長細胞壁；1個細胞的大小約15um×150um。長的細胞壁在東北或西南方向顯示亮藍的偏振光色。藍色細胞壁之間是明亮的黃色。在另一方向（西北或東南）偏振光色相反（圖6和7）。表皮細胞在蜂蜜殘留中大部分聚集在一起。計數單個細胞和聚集細胞，表示為10g蜂蜜中的總數。

用高壓液相色譜技術確定羥甲基糠醛；糖（葡萄糖、果糖和蔗糖含量）也用一種高壓液相色譜方法測定。pH和電導率以20%蜂蜜（m/m）（或蔗糖溶于蒸餾水）測量。電導率在蜂蜜表示為uS/cm。水含量用折射計測量。

2 結果

來自菲律賓和尼泊爾的10個摻假蜂蜜樣本化學的和顯微鏡的分析結果見表1和表2。表中也給出了1種結晶的正常質量的尼泊爾蔗糖以及2種低質量的蔗糖糖蜜細粉的分析結果。

蔗糖蜂蜜樣本為暗棕色或黑色，有蔗糖的回味，其顯微鏡分析未觀察到蔗糖植物細胞。在R128樣本中的花粉粒總數具有正常值；大部分花粉來自棕櫚（Palmeae species）。樣本A485不含花粉，但是有大量的草酸鈣結晶。

表1 蜂蜜和蔗糖樣本的化學性質

3 討論

3.1 蜂蜜樣本

10個蜂蜜樣本的化學數據證明它們全部或部分摻假了，或至少過度加熱了。顯微鏡數據得出的結論是樣本摻假了。蔗糖組織與蔗糖含量沒有直接的相互關系，但是8個尼泊爾樣本的確有大量的蔗糖組織和大量的羥甲基糠醛，它是用酸水解蔗糖漿摻假的指示。2個菲律賓蜂蜜不包括在內，實際上它們不含羥甲基糠醛（它們含有非常低的淀粉酶值，未插在表內），或許用蔗糖直接與蜂蜜混合摻假。

在某些蜂蜜樣本中與蔗糖組織一道有許多小麥淀粉顆粒，可以指出它們用少量的蔗糖糖蜜摻假了。

表2 蜂蜜和蔗糖樣本的顯微鏡特征

3.2 顯微鏡分析

采用偏光顯微鏡（交叉棱鏡和1級紅色阻滯片）使蔗糖組織的鑒定非常容易。使用偏光顯微鏡放大100倍就能鑒別薄壁細胞、硬化細胞、單環和表皮細胞。尤其，第一眼就能看到環。為了正確識別表皮細胞，特別是薄壁細胞和硬化細胞最好采用較大倍率（400倍），或者只用交叉棱鏡，這樣容易檢查出薄壁細胞有特征的小坑。

這10個摻假蜂蜜樣本的薄壁細胞和硬化細胞平均值及標準差和范圍制成表3。

尼泊爾典型的白糖10g樣本含有的薄壁細胞和硬化細胞數為5902。在以前的研究，發現來自不同國家的各種蔗糖，10g中含有單環76～595個；表皮細胞25～222個；薄壁細胞和硬化細胞的數值特別大，通常為3000～6000個。也發現蔗糖含有薄壁細胞、硬化細胞、表皮細胞和環。從這些觀察表明，在鑒別蜂蜜樣本的蔗糖組織時，似乎絕不可能得到假陰性的結果。

不可能有假陽性結果。從在尼泊爾BETRESP工程監督之下的養蜂人得到的蜂蜜樣本，經顯微鏡分析沒發現蔗糖組織；化學分析也顯示正常值。

估計蜂蜜中存在蔗糖的檢測限度為，樣本顯示在載玻片1cm2面積上，10g蜂蜜中最低約有30個薄壁細胞能容易被檢查出來。從這些數據和計算蔗糖中薄壁細胞和硬化細胞數量的自然變量，由此得出的結論是，在樣本中甚至含有1%或2%蔗糖用這種方法就能檢查出來。

表3 10個摻假蜂蜜樣本中薄壁細胞、硬化細胞、環合表皮細胞的平均值及標準差以及范圍

4 結論

蜂蜜樣本甘蔗組織的顯微鏡篩查，對檢測甚至添加到蜂蜜里非常低的蔗糖、轉化糖漿及喂蜜蜂蔗糖產的“蜜”是一種附加方法。本研究中描述的，當檢查蔗糖蜜樣本不含甘蔗植物細胞時，我們可以得出結論：甘蔗組織的存在表明蜂蜜樣本摻假了。計算甘蔗組織，能得到蜂蜜樣本中蔗糖數量的指示。這種方法容易應用在來自發展中國家的蜂蜜分析，用簡單的設備可以做到。與羥甲基糠醛值相結合，顯微鏡方法可以區分加熱和摻假。