整合素拮抗劑IS201對GL15膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

肖 寧，艾文兵，劉彥廷，馮定坤

(三峽大學，湖北宜昌443000)

腦膠質瘤是最為常見的原發(fā)性顱內腫瘤，其惡性程度高、生長快、侵襲性強，目前，臨床上對腦膠質瘤的治療效果不理想。2009年6月～2010年6月進行本研究，擬觀察整合素拮抗劑IS201對體外培養(yǎng)的GL15腦膠質瘤細胞生長的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人GL15膠質瘤細胞。RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、MTT、DMSO、碘化吡啶(PI)、兔抗人增殖細胞核抗原(PCNA)多克隆抗體(一抗)、生物素化山羊抗兔IgG(二抗)、SABC試劑盒、胰蛋白酶、純甲醇、5%BSA封閉液、整合素αvβ3拮抗劑IS201等。

1.2 MTT法 取對數生長期的GL15膠質瘤細胞，實驗組分別加入 IS201，設定濃度為 25、50 μg/ml，對照組加入1640培養(yǎng)基，每種濃度設3個復孔，培養(yǎng)3 d。以570 nm為測試波長，20min內在全自動酶標檢測儀上讀取各孔吸光度(A)值，計算腫瘤細胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=［(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值］×100%。

1.3 免疫細胞化學法 取對數生長期生長良好的GL15細胞消化后，調整為1×104/ml的細胞懸液，以每孔200 μl接種到24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細胞完全貼壁，棄上清液。分別加入含0(對照組)、25 μg/ml(實驗組 1)、50 μg/ml(實驗組 2)整合素αvβ3拮抗劑的細胞培養(yǎng)液200 μl，每種濃度設3個復孔。培養(yǎng)72 h后PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20min后蒸餾水洗滌，室溫干燥。采用免疫組化SABC法，嚴格按照試劑盒要求操作，以PBS代替一抗作為陰性對照，在高倍視野(×400)下隨機選取5個不同視野，取5個視野的平均光密度值(ALD)。ALD越大表示PCNA表達水平越高。

1.4 流式細胞術 取生長良好的GL15膠質瘤細胞在6孔板中培養(yǎng)，細胞貼壁后棄上清液，分別加入含0、25、50 μg/ml整合素αvβ3 拮抗劑的細胞培養(yǎng)液，每種濃度設3個復孔。常規(guī)培養(yǎng)48 h后消化貼壁細胞，得到細胞懸液。使用流式細胞儀檢測各孔細胞。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0軟件對所得結果進行單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 增殖抑制率結果 對照組、實驗組1、實驗組2 GL15膠質瘤細胞增殖抑制率分別為0、16.10%±8.86%、25.37%±7.15%，實驗組與對照組比較抑制率均明顯增加(P均＜0.05)，實驗組2較實驗組1抑制率也增加(P＜0.05)。

2.2 PCNA表達結果 對照組PCNA表達的ALD為0.698 4±0.037 6，實驗組 1為 0.409 1±0.033 6，實驗組2為0.287 6±0.043 7，兩實驗組與對照組比較差異均有統計學意義(P均＜0.05)，兩實驗組之間比較亦有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 細胞凋亡結果 見表1。

表1 IS201對膠質瘤細胞周期的影響(%，±s)

表1 IS201對膠質瘤細胞周期的影響(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別 G0/G1 S G2/M SubG1對照組42.30±3.84 6.16±0.41 48.60±0.67 2.95±0.95實驗組1 39.42±0.97 4.35±0.57 46.38±1.44 9.84±2.16*實驗組2 37.30±1.02 8.84±1.12 41.27±2.58 12.54±0.46*

3 討論

在膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中整合素αvβ3參與血管生成、多種生長因子與其受體相互作用、細胞與細胞及細胞與細胞外基質之間黏附等生理過程，亦與人體許多其他惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、新血管形成和侵襲轉移等病理生理過程密切相關［1］。但有關整合素αvβ3在腦膠質瘤惡性增殖、血管生成和侵襲性生長過程中作用的研究，仍處于探索階段。研究表明，整合素αvβ3在膠質瘤中明顯表達，且隨著膠質瘤病理級別的升高，其表達水平明顯升高，還與其血管內皮生長因子(VEGF)和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達呈正相關［3］。這些事實提示，整合素αvβ3可能在腦膠質瘤的惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用，整合素αvβ3極有可能成為人腦膠質瘤綜合治療中的一個很有前途的靶點。

體外實驗證實，整合素αvβ3對膠質瘤細胞和血管內皮細胞的黏附、遷移和增殖能力有明顯的促進作用［3］;抗整合素 αvβ3 的 LM609、抗整合素αvβ3和αvβ5的EMD121974等抗體，在體內外的實驗中均顯示出良好的抗膠質瘤血管生成及抑制體外培養(yǎng)的GL15腦膠質瘤細胞增殖和侵襲等作用［4］。這些研究結果進一步證實，整合素αvβ3對膠質瘤惡性生物學行為有正性調節(jié)作用。

IS201是另一種新發(fā)現的整合素αvβ3拮抗劑，不同于現有的整合素αvβ3拮抗劑，它有一個模擬RDG結合位點的環(huán)狀結構，故是一種高選擇性的整合素αvβ3拮抗劑［5］。目前對 IS201的研究尚處于實驗室階段，國內外的相關報道并不多。動物研究表明，IS201能夠降低大鼠C6腦膠質瘤的血管生成和腫瘤細胞增殖，對C6膠質瘤的生長有明顯抑制作用［6］。本課題通過實驗觀察IS201對體外培養(yǎng)的GL15人腦膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響，證實IS201對人腦膠質瘤確有抑制作用，為下一步將其應用于臨床試驗提供了理論基礎。

［1］蔡強，葉應湖，王國安，等.血管內皮生長因子在人腦膠質瘤侵襲中的作用［J］.腫瘤防治研究，2002，29(6):447-449.

［2］艾文兵，陶勝忠，薛德麟.人腦膠質瘤中VEGF和整合素αvβ3的表達及相關性研究［J］.腫瘤防治研究，2005，32(2):70-72.

［3］D'Abaco GM，Ng K，Paradiso L，et al.ADAM22，expressed in normal brain but not in high-grade gliomas，inhibits cellular proliferation via the disintegrin domain［J］.Neurosurgery，2006，58(1):179-186.

［4］馮定坤，艾文兵，劉彥廷，等.整合素αvβ3抗體對膠質瘤細胞增殖和侵襲力的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(2):4-5.

［5］孫沛，許云祿.整合素及其拮抗劑研究進展［J］.藥學專論，2007，16(1):1-3.

［6］艾文兵，馮定坤，熊志云，等.整合素αvβ3拮抗劑治療大鼠腦膠質瘤的實驗觀察［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(6):32-33.